血清Cys C及其+73、-82位點基因多態性與廣西壯族人群代謝綜合征發病的關系

俞開敏，楊蘭，陸俊佳

(1廣西壯族自治區人民醫院，南寧530021；2南寧市第二人民醫院)

血清Cys C及其+73、-82位點基因多態性與廣西壯族人群代謝綜合征發病的關系

俞開敏1，楊蘭2，陸俊佳2

(1廣西壯族自治區人民醫院，南寧530021；2南寧市第二人民醫院)

目的 探討血清胱抑素C(Cys C)及其+73和-82位點基因多態性與廣西壯族人群代謝綜合征(MS)發病的關系。方法 選擇壯族MS患者和漢族MS患者各100例(分別為壯族MS組和漢族MS組)，同期體檢健康的壯族和漢族志愿者各100例(分別為壯族健康組和漢族健康組)。采用免疫比濁法檢測各組血清Cys C、肌酐(Cr)，聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性法檢測Cys C+73、-82位點基因多態性。結果 血清Cys C、Cr水平：壯族MS組均高于壯族健康組，漢族MS組均高于漢族健康組(P均<0.01)；壯族MS組與漢族MS組比較、壯族健康組與漢族健康組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。血清Cys C與Cr水平呈正相關(r=0.634，P<0.01)。四組Cys C +73、-82位點等位基因頻率兩兩比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。結論 廣西壯族MS患者血清Cys C水平升高，可反映患者的腎功能狀態；Cys C +73、-82位點基因多態性可能與MS的發病及民族情況均無關。

代謝綜合征；胱抑素C；基因多態性；腎功能；壯族；廣西地區

代謝綜合征(MS)是一組多種代謝異常聚集的病理狀態和臨床癥侯群，MS患者多伴有高血壓、血脂升高、糖耐量降低以及肥胖，是心血管疾病的主要危險因素。胱抑素C(Cys C)是反映腎小球濾過功能的內源性標志物，可調節特異性組織蛋白酶的活性，影響細胞外基質產生、降解的動態平衡以及粒細胞的吞噬、趨化作用，也與心血管疾病的發生密切相關，其基因突變位點及其頻率分布受人種、地域等因素的影響較大。本研究探討廣西壯族MS發病與患者血清Cys C及其+73、-82位點基因多態性的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年6月～2015年1月廣西壯族自治區人民醫院收治的壯族MS患者和漢族MS患者各100例(分別為壯族MS組和漢族MS組)，同期體檢健康的壯族和漢族志愿者各100例(分別為壯族健康組和漢族健康組)。MS的診斷標準參照《中國成人血脂異常防治指南》[3]。壯族MS組及壯族健康組要求至少三代以上未與外族通婚，各組均無遺傳性疾病家族史及其他急慢性病史，各組間均無血緣關系。壯族MS組男52例、女48例，年齡46～75歲、中位年齡53.1歲；壯族健康組男55例、女45例，年齡50～71歲、中位年齡53.9歲；漢族MS組男55例、女45例，年齡47～78歲、中位年齡54.3歲；漢族健康組男53例、女47例，年齡49～72歲、中位年齡54.4歲。各組性別、年齡均具有可比性。本研究獲得醫院倫理委員會審核，受試者均知情同意。

1.2 血清Cys C和肌酐(Cr)水平檢測 抽取各組空腹靜脈血3 mL，注入干燥管中。靜置30 min后，低速(3 000 r/min)離心10 min，分離血清后-20 ℃冰箱保存。應用日立7600全自動生化儀，采用免疫比濁法檢測血清Cys C和Cr。

1.3 Cys C +73、-82位點基因多態性檢測 采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性法。取各組空腹靜脈血2 mL于EDTA抗凝管，充分混勻，嚴格按照DNA抽提試劑盒(北京天根生化科技有限公司)說明書操作制備全血DNA，-20 ℃保存備用。根據GenBank提供的Cys C基因啟動子序列，采用Primer5.0軟件設計引物：Cys C +73上游引物：5′-TCTATCTAGCTCCAGCCTCTCG-3′，下游引物：5′-TGCTGGCTTTGTTGTACTCG-3′，引物長度254 bp；Cys C-82上游引物：5′-GATGGATGGGGAAGGACAG-3′，下游引物：5′-CAGGATGGCCAGCAGGAG-3′，引物長度379 bp。PCR反應體系共50 μL：PCR混合反應液8 μL(含dNTP、buffer)、Taq酶 0.5 μL、無菌水37.5 μL、DNA模版2 μL，上、下游引物各1 μL。擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環；72 ℃延伸5 min。進行基因位點限制性片段長度多態性分析：①Cys C +73位點：PCR后產物20 μL、NgoMⅣ內切酶1 μL，buffer 3 μL，無菌水6 μL，37 ℃酶切1 h。PCR產物長度為254 bp(A等位基因)，酶切后為63和191 bp的兩個片段(G等位基因)。②Cys C-82位點：PCR后產物20 μL、SacⅡ內切酶1 μL，buffer 3 μL，無菌水6 μL，37 ℃酶切1 h。PCR產物長度為379 bp(C等位基因) ，酶切后為179和200 bp的兩個片段(G等位基因)。將5 μL酶切后產物在2%瓊脂糖凝膠上點樣，電壓100 V，電泳30 min后凝膠圖象分析儀下觀察電泳結果并攝像保存，記錄Cys C +73、-82位點基因型，并計算等位基因頻率。

2 結果

2.1 四組血清Cys C、Cr水平比較 血清Cys C、Cr水平：壯族MS組均高于壯族健康組，漢族MS組均高于漢族健康組(P均<0.01)；壯族MS組與漢族MS組比較、壯族健康組與漢族健康組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；見表1。直線相關性分析結果顯示，血清Cys C與Cr水平呈正相關(r=0.634，P<0.01)。

表1 四組血清Cys C、Cr水平比較

注：與壯族健康組比較，*P<0.01；與漢族健康組比較，#P<0.01。

2.2 四組Cys C +73、-82位點基因型及等位基因頻率比較 Hardy-Weinberg平衡檢驗結果顯示，Cys C +73、-82位點基因分布符合群體遺傳平衡法則，具有群體代表性(P均>0.05)。四組Cys C +73、-82位點等位基因頻率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 四組Cys C +73、-82位點基因型及等位基因頻率

3 討論

MS是環境因素、多基因遺傳因素和不良生活習慣綜合作用而引起的綜合征[1]， 其引發的多種代謝異常均為心血管疾病的重要危險因素。Cys C表達于所有有核細胞，參與機體許多生理和病理過程，除了作為評價腎小球濾過功能的一個重要指標外[2]，還可與組織蛋白酶等胱抑素酶形成緊密復合物，從而抑制組織蛋白酶的活性，影響細胞外基質產生和降解的動態平衡，以及粒細胞的吞噬及趨化作用，參與AS和炎癥反應的病理過程[3，4]。Cys C是心血管事件的一個獨立預測因子，也是心血管事件發生及死亡的潛在預測因子[5～7]。因此推測Cys C可能與MS有關。本研究結果顯示，壯族MS組血清Cys C及Cr水平均明顯高于壯族健康組，漢族MS組均明顯高于漢族健康組，與以往研究[8，9]結果相似。直線相關性分析顯示，血清Cys C與Cr水平呈正相關，進一步證明Cys C是評價腎濾過功能的一項可靠指標。但本研究部分研究對象臨床信息不全，不能進一步分層，故血清Cys C水平能否作為MS患者發生心血管事件的預測因子仍需進一步完善。

Cys C編碼基因位于染色體20p11.2，是cystatin超家族的成員之一[10]。有前瞻性隊列研究發現，Cys C基因突變可能引起其合成和分泌降低，使Cys C酶的抑制功能減弱，導致機體發生一系列生理、病理改變[11,12]。Cys C基因突變主要在基因啟動子處，且基因突變及其頻率分布受人種、地域等因素的影響較大[13]。國內關于Cys C基因多態性與MS的關系研究較少。有研究發現，Cys C+73位點的A/G突變導致了信號肽倒數第2位的丙氨酸被蘇氨酸替換，而這種替換改變了Cys C向內質網和高爾基復合體的輸運，通過中斷信號肽與成熟蛋白的斷裂來修飾Cys C的分泌加工途徑，從而引起Cys C分泌減少或活性降低[14,15]。本研究結果顯示，四組Cys C +73、-82位點等位基因頻率比較差異無統計學意義。分析原因：①Cys C +73、-82位點基因多態性不是廣西地區MS發病的候選基因位點；②Cys C +73、-82位點G等位基因可能與廣西地區MS的發生、發展有關，但因本研究觀察的樣本例數較少，研究人群代表性還不夠強，不足以檢測出其相關性。

綜上所述，廣西壯族MS患者血清Cys C水平升高，血清Cys C水平可反映患者的腎功能狀態； Cys C +73、-82位點基因多態性在漢族與壯族人群中比較無明顯統計學差異，其是否是壯族MS發病的易感基因，還需進一步研究。

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廣西壯族自治區衛生廳自籌經費科研課題(Z2013677)；南寧市科學研究與技術開發計劃(ZC20133005)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.027

R589

B

1002-266X(2017)16-0080-03

2016-08-18)