紫芪方對失血性休克大鼠腸道通透性的影響

史成和，吳成林，張達矜，安懷杰，李玉軍

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紫芪方對失血性休克大鼠腸道通透性的影響

史成和，吳成林，張達矜，安懷杰，李玉軍

［摘要］目的 觀察紫芪方對失血性休克Wistar大鼠腸道通透性的影響。方法 實驗采用Wistar大鼠，按照改良Wigger’s法復制失血性休克模型，然后將模型大鼠隨機分為正常對照組、失血性休克組、紫芪方組、參附組及蒸餾水組（各組n=6）。除正常對照組和休克組，其他組在給予2倍失血量液體復蘇后分別灌胃給予不同干預藥物，觀察腸道黏膜組織結構變化，并測定血漿內毒素含量、腸道細菌移位情況、血漿D-乳酸含量和血漿二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）含量。結果 紫芪方組腸黏膜損傷程度明顯輕于失血性休克組。紫芪方組血漿內毒素含量、血漿細菌移位菌落數、肝臟細菌移位菌落數和血漿D-乳酸分別為（177.0±45.0）EU/ L、（29±8）CFU、（31±16）CFU、（0.39±0.04）mmol/ L，較失血性休克組顯著降低（P＜0.01）。紫芪方組血漿DAO含量為（0.40±0.06）kU/ L，較失血性休克組降低（P＜0.05），且紫芪方在降低血漿細菌移位菌落數、肝臟細菌移位菌落數和血漿DAO 3個方面的效應強于陽性對照藥物參附（P＜0.05）。結論 紫芪方對失血性休克大鼠腸道通透性有保護作用，為紫芪方保護腸道屏障功能的有效性提供了重要依據。

［關鍵詞］紫芪方；失血性休克；腸道通透性

［作者單位］100048北京，海軍總醫院中心實驗科（史成和，吳成林，張達矜，安懷杰）；100841北京，海軍司令部直屬衛生處（李玉軍）

失血性休克是大量失血后引起有效循環血量驟減、組織灌注嚴重不足、細胞代謝出現紊亂以及功能受到損傷的過程［1］。在平時和戰時，失血性休克都是導致創傷傷員死亡的重要原因之一。文獻報道，有32.6%～59.5%的傷員在戰時死于失血性休克［2］。休克時，全身多個內臟器官會發生損傷，其中腸道組織能量代謝變化最早、恢復最遲，使其成為休克的重要靶器官［3］；另一方面，腸道是體內最大的“儲菌所”和“內毒素庫”，其功能一旦受損，通透性就會增加，細菌和內毒素就會發生移位，進而介導釋放多種炎癥介質，導致腸道及其他內臟器官功能損傷的加重。因此，在失血性休克的過程中，腸道既可以作為損傷的“靶”器官，又可成為損傷的“激發”器官，保護腸道功能對于減少失血性休克損傷具有重要意義。

目前失血性休克的早期治療主要是及早大量補液擴充血容量，并在合適時機使用一些微循環保護藥物配合治療［4］。近年來，借助現代提煉技術制成的中藥制劑逐漸用于臨床，如具有活血化瘀、疏通經絡功能的參附注射液，可通過增加小腸黏膜固有層IgA的含量，降低黏膜細胞凋亡指數、血漿內毒素及炎性因子含量，保護腸道黏膜屏障功能，從而達到抗失血性休克的作用［5-7］。紫芪方由人參、白芨、大黃等組成，具有扶正固脫、通瘀開閉、清熱解毒等作用。前期研究表明，紫芪方可通過減少細胞凋亡和乳酸脫氫酶漏出量及保護細胞線粒體膜電位對腸上皮細胞系ICE-6細胞缺氧復氧損傷起保護作用［8-10］。本實驗擬通過觀察腸道黏膜組織結構變化并測定Wistar大鼠血漿內毒素含量、腸道細菌移位情況、血漿D-乳酸含量和二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）含量，觀察紫芪方對失血性休克模型大鼠腸道通透性的保護作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物與主要試劑 健康成年Wistar雄性大鼠30只，清潔級，體質量（230±20）g，由第三軍醫大學野戰外科研究所動物室提供［SCXK-（渝）-2002-003，標準二級動物房］。黃芪、大黃、人參、附子、丹參、白芨（重慶中藥研究所秦松云教授進行鑒定）。紫芪方（人參、附子、黃芪、丹參、大黃、白芨各配伍比例為1∶1∶1∶1∶1∶1），陽性對照藥物——參附（人參、附子配伍比例為2∶1）。按量稱取不同組分藥物，清水浸泡1 h，煎煮3次（30、15、15 min），合并煎液濃縮，當相對密度達到1. 2左右時，加入95%乙醇至藥液含醇量為70%，靜置過夜，采用水浴蒸發的方法至藥液無乙醇味后加入蒸餾水，經過濾收集于密閉容器內（生藥/水為0.5 g/ mL）。D-乳酸標準液、D-乳酸脫氫酶、鄰茴香胺甲醇溶液、尸胺二氫氯化物、辣根過氧化物酶和DAO標準液均購自Sigma公司，內毒素檢測鱟試劑購自南京建成生物工程研究所。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組和失血性休克模型制備 30只Wistar大鼠常規飼養7 d后采用隨機數字表法隨機分為正常對照組、失血性休克組、失血性休克2倍平衡鹽水復蘇加紫芪方治療組（紫芪方組）、失血性休克2倍平衡鹽水復蘇加參附治療組（參附組）、失血性休克2倍平衡鹽水復蘇加蒸餾水治療對照組（蒸餾水組），每組6只。失血性休克采用改良Wigger’s模型［11］，實驗前1 d天動物禁食過夜，自由飲水。實驗當天動物按50 mg/ kg腹腔注射3%戊巴比妥鈉進行麻醉，右股動脈插管，全身肝素化（肝素500 U/ kg），連接三通裝置，然后分別進行注射器和血壓計的連接，供股動脈放血和血壓測定用。動物放血約10 min，待血壓降到40 mmHg，將該血壓維持2 h。

1.2.2給藥方法 參照文獻［12］使用的藥物劑量，為正常人體使用劑量的5倍以上。紫芪方組、參附組和蒸餾水組于血壓保持40 mmHg 2 h后，靜脈首先給予2倍失血量的平衡鹽液，然后采用灌胃的給藥方式分別給予4.5 mL紫芪方、4.5 mL參附和4. 5 mL蒸餾水。取5 mL的注射器，對上述藥液進行抽取并連接針頭。固定大鼠于左手，保持頭頸平直，裝有藥液的注射器持于右手，將針頭沿口角左側，經口腔徐緩插入胃中，并注入藥液。于治療5 h后活殺動物，收集血漿、腸組織樣本。

1.3檢測指標和方法

1.3.1腸黏膜組織蘇木素-伊紅染色 迅速取部分回腸（距回盲部5 cm），于預冷的生理鹽水中輕洗2次、去除殘留腸內容物。切取部分組織塊（1. 0 cm× 0. 5 cm），浸入10%中性緩沖甲醛液中固定（20倍蘇木素-伊紅于樣本大小的量），30 min以上。石蠟包埋切片，厚度4 μm，常規蘇木素-伊紅染色后光鏡下觀察腸黏膜組織結構。

1.3.2血漿檢測指標 血漿內毒素定量測定采用鱟試劑基質偶氮顯色法；血漿D-乳酸和DAO測定用分光光度法。

1.3.3細菌移位 動物臟器細菌定量培養，按照前述實驗分組，無菌采集血漿及活殺大鼠后剪取肝臟及腸系膜淋巴結，稱肝臟及腸系膜淋巴結后置于玻璃勻漿器中進行勻漿，低溫離心（3 000 r/ min，15 min），取100 μL上清液接種于血培養皿進行培養，置于37℃孵箱中孵育24 h后計數。

1.4統計學處理 應用SPSS 17. 0軟件，計量資料用均數±標準差（±s）進行表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1大鼠腸道黏膜組織結構變化 蘇木素-伊紅染色后觀察正常對照組大鼠腸黏膜組織發現其結構完整，排列整齊，腸上皮細胞緊密連接，形成完整的機械屏障；失血性休克組腸黏膜出現固有層水腫，中央乳糜管擴張，黏膜上皮下間隙形成，腸上皮細胞大量脫落，固有層淋巴細胞增多。紫芪方治療后腸黏膜可見少數中性粒細胞浸潤，中央乳糜管輕度擴張，但腸黏膜上皮比較完整，少量腸上皮細胞脫落（圖1）。

圖1　大鼠腸道黏膜組織結構變化（蘇木素-伊紅染色，×200）

2.2大鼠頸動脈血漿內毒素含量 正常對照組血漿內毒素含量為（41.3±14.3）EU/ L。失血性休克后大鼠頸動脈血漿內毒素含量顯著升高，為（295.3± 34.3）EU/ L，與正常對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。經紫芪方、參附治療后血漿內毒素水平均明顯降低，分別為（177.0±45.0）、（194.3±51.5）EU/ L，2組比較差異無統計學意義（P＞0.05），與失血性休克組比較差異均有統計學意義（P＜0.01）。蒸餾水組血漿內毒素水平為（246.0±33.4）EU/ L，與紫芪方組和參附組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3大鼠細菌移位 正常對照組的血漿樣本和臟器勻漿樣本經細菌定量培養后，未觀察到明顯的菌落形成。失血性休克組和蒸餾水組的血漿、肝臟及腸黏膜淋巴結樣本經培養后均可見大量菌落出現。與失血性休克組比較，紫芪方組（P＜0.01）和參附組（P＜0.05）菌落數均顯著降低；且紫芪方組較參附組效果更好（P＜0.05），血漿樣本僅為參附組的32%，肝臟樣本為參附組的45%。腸系膜淋巴結樣本結果沒有顯示出規律性的變化（表1）。

表1　大鼠不同臟器細菌移位的菌落數（±s，CFU，各組n=6）

表1　大鼠不同臟器細菌移位的菌落數（±s，CFU，各組n=6）

注：與失血性休克組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與蒸餾水組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01；與參附組比較，#P＜0.05

組別　　血漿　　肝臟　　腸系膜淋巴結正常對照組　0　0　0失血性休克組　120±32　100±29　8±4紫芪方組　29±8**▲#　31±16**▲#　0參附組　91±16*△　69±10*△　0蒸餾水組　135±12　106±21　0

2.4大鼠血漿D-乳酸含量 正常對照組血漿D-乳酸含量為（0.26±0.02）mmol/ L。失血性休克組大鼠血漿D-乳酸含量與正常對照組大鼠相比，明顯升高［（0.58±0.06）mmol/ L］，差異有統計學意義（P＜0.01）。紫芪方組、參附組和蒸餾水組血漿D-乳酸含量分別為（0.39±0.04）、（0.37±0.05）、（0.55± 0.04）mmol/ L；與失血性休克組和蒸餾水組相比，紫芪方組和參附組血漿D-乳酸含量均顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；但紫芪方組和參附組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.5大鼠血漿DAO含量 正常對照組血漿DAO含量為（0.1±0.03）kU/ L。與正常對照組相比，失血性休克組血漿DAO含量顯著升高［（0.69±0.19）kU/ L］，差異有統計學意義（P＜0.01）。紫芪方組、參附組和蒸餾水組血漿DAO含量分別為（0.40±0.06）、（0.49±0.10）、（0.57±0.08）kU/ L；與失血性休克組和蒸餾水組相比，經紫芪方、參附治療后血漿DAO含量均明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；且紫芪方組低于參附組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3　討論

腸道通透性是指分子通過非載體依賴擴散方式通過腸道上皮細胞層的特性，與腸屏障功能密切相關［13］。腸屏障可以分為機械屏障、化學屏障、免疫屏障與生物屏障4個層次，在正常情況下腸黏膜可以維持一定的通透性、吸收營養物質和抵御外界致病性抗原的入侵［14］。由于小腸絨毛微血管呈網囊型結構，對體循環血壓的改變十分敏感，使得發生休克時腸黏膜極易出現缺血、缺氧性損害［15-16］，導致腸屏障功能受損、黏膜通透性增加。本研究結果證實正常對照組大鼠腸黏膜絨毛排列整齊，上皮細胞結構完整；失血性休克導致的腸道損傷后可見絨毛破損，上皮細胞變性、脫落病理學改變；紫芪方治療后大鼠腸絨毛結構基本完整。從形態學角度上看，紫芪方對腸上皮細胞具有明顯的保護作用。

內毒素的主要化學成分是革蘭陰性菌細胞壁外部的脂多糖，可分為類脂A、核心多糖和特異多糖3部分。當腸屏障受到破壞時，腸道內毒素可移位進入血液循環，引起內毒素血癥［17］。本研究發現失血性休克大鼠血漿內毒素含量顯著升高，而經紫芪方和參附治療后，大鼠血漿內毒素的含量明顯降低，說明紫芪方和參附能夠增強腸道的選擇通透性功能。

正常情況下，腸道內寄居著大量的正常菌群，但是當腸屏障功能受損后，腸道內的細菌會穿過腸道黏膜進入正常無菌的組織，如腸系膜淋巴結、肝、脾、血液及更遠處器官，這個過程被稱為細菌移位［18］。本研究對不同處理條件的實驗動物的血漿、肝臟和腸系膜淋巴結勻漿液進行細菌定量培養，與正常對照組顯示的無培養菌落出現相比，失血性休克大鼠的上述樣本經過血平皿培養，呈現大量菌落；提示腸黏膜上皮細胞受損嚴重，腸道通透性增加，進而導致腸道細菌進入循環系統和其他臟器，發生細菌移位。經紫芪方和參附治療后，細菌菌落明顯減少；提示紫芪方和參附可以保護腸黏膜上皮細胞，維持腸道正常的通透性，減少細菌移位，且紫芪方效果強于參附。

D-乳酸是胃腸道內的固有細菌的代謝終產物，而哺乳動物自身既不會產生，也缺乏代謝D-乳酸的酶類，因此當各種因素導致腸道通透性增加時，D-乳酸即可進入血液循環引起血漿D-乳酸含量的升高［19-20］。DAO是主要存在于人類和哺乳動物的小腸黏膜上層的絨毛上皮細胞胞漿中的細胞內酶，除少量分布于子宮內膜絨毛中，其他組織或細胞中基本沒有DAO分布。正常條件下血漿DAO含量很低，因此DAO能較準確地反映小腸黏膜的結構功能。當腸黏膜上皮細胞受到損傷，腸屏障結構受到破壞時，腸黏膜絨毛上皮細胞會釋放大量的DAO入血，使血中DAO含量迅速升高。通過測定血漿DAO含量，尤其在無創情況下測定能更直接地反映腸上皮細胞及腸屏障結構的損傷和修復情況［21-22］。本研究發現，失血性休克導致的腸缺血、缺氧或再灌注損傷后D-乳酸和DAO含量顯著升高，表明腸黏膜上皮細胞大量受損，腸道通透性增加，D-乳酸和DAO進入血液循環引起血中D-乳酸和DAO水平的升高；經過紫芪方治療后，可抑制D-乳酸和DAO的升高，表明紫芪方具有保護腸黏膜上皮細胞的作用，進而維持正常的腸道通透性和屏障功能。

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Effect of Ziqi compound on the intestinal permeability of rats with hemorrhagic shock

SHI Chenghe1，WU Chenglin1，ZHANG Dajin1，AN Huaijie1，LI Yujun2
（1. Center for Basic Medical Science，Navy General Hospital，Beijing 100048，China；2. Department of Health of Navy Command，Beijing 100841，China）

［Abstract］Objective To observe the influence of Chinese herb medicine（Ziqi）on the intestinal permeability of male Wistar rats with hemorrhagic shock. Methods Hemorrhagic shock model was produced by modified Wigger’s model. Male Wistar rats were divided into five groups randomly（the normal group，the hemorrhagic shock group，the resuscitation and Ziqi compound treatment group，the resuscitation and Shenfu treatment group，the resuscitation and distilled water treatment control group，n = 6）. Except for the normal and hemorrhagic shock group，different drugs were given by gastric perfusion after resuscitation with double blood loss of liquid. The structure changes of intestinal mucosa and content of endotoxin in plasma，numbers of translocation of bacteria，content of D-lactic acid and diamine oxidase（DAO）in plasma were evaluated. Results The degree of intestinal injury in Ziqi group was significantly less serious than that in hemorrhagic shock group. Levels of endotoxin in plasma（177. 0±45. 0）EU/ L，numbers of bacteria from plasma（29± 8）CFU and liver tissues（31±16）CFU，and levels of D-lactic acid in plasma（0. 39±0. 04）mmol/ L in Ziqi compound group decreased markedly as compared with those in hemorrhagic shock group（P＜0. 01）. Levels of DAO in plasma（0. 40±0. 06）kU/ L in Ziqi compound group decreased as compared with those in hemorrhagic shock group（P＜0. 05）. The effect of Ziqi compound in decreasing numbers of bacteria from plasma and liver tissues，and levels of DAO in plasma was stronger than the effect of the positive control drug Shen-Fu compound（P＜0. 05）. Conclusion Ziqi compound has significant protective effect on maintaining intestinal permeability，which provides an important basis for the protection of the intestinal barrier function by Ziqi compound.

［Key words］Ziqi compound；Hemorrhagic shock；Intestinal permeability

［中圖分類號］R285

［文獻標志碼］A

［文章編號］2095-3097（2016）02-0087-05

doi：10. 3969/ j. issn. 2095-3097. 2016. 02. 006

［基金項目］軍隊后勤科研計劃重點項目（BHJ14C009）

收稿日期：（2015-06-15 本文編輯：張在文）