胃黏膜組織TNF- α及iNOS表達水平與胃炎發病及細胞凋亡的相關性研究

陳東

(長沙市第一醫院 急診科,湖南 長沙　410005)

胃黏膜組織TNF-α及iNOS表達水平與胃炎發病及細胞凋亡的相關性研究

陳東

(長沙市第一醫院 急診科,湖南 長沙410005)

[摘要]目的：探討腫瘤壞死因子α(TNF- α)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)與胃炎發病及細胞凋亡的相關性。方法：選取2012年2月至2014年3月間收治的112例胃炎患者作為研究組,56例健康受檢者作為對照組。所有受檢者入院次日進行血壓、心率、肝功能、血常規等常規項檢查。研究組患者接受TNF- α、iNOS以及細胞凋亡檢查,再將患者按照病情嚴重程度分為輕度、中度、重度3組,比較組間差異；同時采用TUNEL法檢測患者胃黏膜組織的細胞凋亡情況,并采用Pearson相關性分析研究TNF- α及iNOS表達與胃炎發病和細胞凋亡的相關性。結果：(1) 患者病情越嚴重TNF- α與iNOS水平越高,均明顯高于健康對照組。(2) 凋亡細胞形態、大小、染色較正常細胞均有明顯不同；同時,TNF- α≥1.0 ng·mg-1的陽性細胞指數(AI)顯著高于TNF- α<1.0 ng·mg-1,iNOS≥100個·mm-2時AI顯著高于iNOS<100 個·mm-2,TNF- α和iNOS不同亞組之間AI差異均有統計學意義,P<0.05。(3) 患者TNF- α和iNOS均與胃炎發病和細胞凋亡呈正相關,差異具有統計學意義。結論：TNF- α和iNOS的過量分泌可能引發胃炎患者胃黏膜的炎癥反應,二者還可能誘導胃黏膜細胞凋亡。

[關鍵詞]腫瘤壞死因子α； 誘導型一氧化氮合酶； 胃炎； 細胞凋亡

胃炎是一種常見的消化系統疾病,可由多種不同病因引起,常伴有黏膜炎癥反應或上皮組織損傷,臨床表現為上腹脹、嘔吐、噯氣、食欲不振、反酸等[1]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)由激活的巨噬細胞分泌,具有顯著的抗腫瘤活性,是一種直接殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯毒性的細胞因子[2]。誘導型一氧化氮合酶(iNOS)是一種存在于神經元及免疫細胞中的同工酶,可在細胞受到刺激時被激活生成大量NO,協助巨噬細胞對抗病原體[3]。研究表明,胃炎患者胃黏膜損傷及繼發產生的細胞凋亡與上述二者有關。因此,本研究探討了TNF-α和iNOS的表達與胃炎發病及細胞凋亡的相關性[4]。

1資料與方法

1.1一般資料

本研究對象為112例胃炎患者和56例健康受檢者,分別作為研究組和對照組。研究組男65例,女47例,平均年齡(36.7±13.7)歲；對照組男30例,女26例,平均年齡(38.8±11.4)歲。病例納入標準：(1) 所有患者經病理學檢查確診為胃炎；(2) 受檢前未服用其他任何抗生素類、質子泵抑制劑等含硝基類藥物。病例排除標準：(1) 合并嚴重臟器功能性衰竭者；(2) 不能配合者；(3) 嚴重精神疾病者。試驗過程已通知所有患者及其家屬,并簽署知情同意書。兩組基本資料差異無統計學意義(P>0.05),詳見表1。

表1基本資料比較

Tab 1Comparison of basic data

組 別男∶女平均年齡/歲病程/年心率/次·min-1血壓/mmHg研究組65∶4736.7±13.73.5±2.374.2±5.789.4±6.3對照組30∶2638.8±11.4-73.5±4.887.8±5.2t/χ2值1.4621.102-1.7461.635P值>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05

1.2方法

兩組入院次日進行血壓、心率等常規項檢查。禁食10 h后于距幽門2.5 cm處的大彎、小彎、前壁、側壁各取2塊黏膜組織,分別用于TNF-α、iNOS的檢測。將研究組患者按照病情嚴重程度分為輕度、中度、重度3組,比較組間TNF-α、iNOS差異,同時分析其與胃炎發病和細胞凋亡的相關性。

1.3檢查指標及測定方法

1.3.1TNF-α的測定取胃黏膜組織洗滌干凈后稱重,加入生理鹽水后粉碎,3 500 r·min-1離心10 min取上層液,-4 ℃以下冷藏保存待測。采用間接酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定TNF-α水平,TNF-α水平(ng·mg-1)=TNF-α測得值(ng)/組織濕重(mg)。ELISA試劑盒由上海博谷生物科技有限公司提供；所使用儀器為全自動酶聯免疫分析儀(北京歐蒙生物技術有限公司)。

1.3.2iNOS的測定采用免疫組化方法測定iNOS,步驟如下：(1) 切片常規脫蠟至水；(2) 尿素消化30 min；(3) 1%H2O2封閉內源酶30 min；(4) 加入羊血清37 ℃下保溫30 min；(5) 滴加一抗4 ℃12 h；(6) 分別滴加生物素化羊抗兔IgG和ABC復合物,37 ℃下依次保溫40 min；(7) 以DAB顯色,蘇木素復染,常規封片；(8) 黃色或棕黃色陽性信號出現于細胞質。400倍光鏡下觀察相對染色較強、陽性細胞較多的視野, 統計陽性染色細胞數目,iNOS(個·mm-2)=陽性染色細胞數目/視野面積。

1.3.3細胞凋亡的檢測采用原位末端標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡,步驟如下：取樣后以4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,脫蠟入水,3%H2O2處理10 min,TBS 1∶200稀釋、Proteinase K消化、TBS洗滌,然后依次加標記緩沖液、封閉液、抗體稀釋液后以DAB顯色,蘇木素復染,最終洗滌脫水封片,于顯微鏡下觀察。細胞核中可見棕黃色顆粒者即為凋亡細胞。以陽性細胞指數(AI)評價細胞凋亡情況：每張切片隨機選取5個400倍視野,每個視野至少1 000個細胞,各個視野下陽性細胞數占總細胞數的比值的均值即為AI(%)。

1.4病情判斷標準

所有患者根據胃黏膜的炎癥程度將病情分為輕度、中度、重度：(1) 重度：全黏膜層幾乎完全被炎癥細胞浸潤,并伴有黏膜上皮細胞壞死、變性等；(2) 中度：炎癥細胞浸潤面積為全黏膜層的1/3到2/3；(3) 輕度：炎癥細胞浸潤較輕,不超過全黏膜層的1/3[5]。

1.5統計學處理

本研究采用SPSS 17.0進行數據處理。計數資料以率表示,采用χ2檢驗；計量資料采用t檢驗,采用Pearson檢驗進行相關性分析。P<0.05表明差異具有統計學意義。

2結果

2.1TNF- α及iNOS與病情嚴重程度相關性

患者病情越嚴重TNF-α與iNOS水平越高,且均明顯高于健康對照組,差異有統計學意義,P<0.05,詳見表2。

2.2TUNEL實驗結果

胃炎患者凋亡細胞體積小,細胞核染成棕色,形態呈多種不規則狀,大小不一,多分布于腺體各處。非凋亡細胞未見體積濃縮,細胞呈藍色,細胞核較大,形態多呈類圓形或橢圓形,大小較一致。健康對照組胃炎黏膜標本少見凋亡細胞,主要分布于黏膜表層。TNF-α≥1.0 ng·mg-1的AI顯著高于TNF-α<1.0 ng·mg-1,iNOS≥100 個·mm-2時AI顯著高于iNOS<100 個·mm-2,TNF-α和iNOS不同亞組之間AI差異均有統計學意義,P<0.05。詳見表3。

表2TNF-α及iNOS與病情嚴重程度相關性

Tab 2Correlation between TNF-α, iNOS and illness severity

組 別nTNF-α/ng·mg-1iNOS/個·mm-2輕度組550.57±0.1268.2±25.3中度組331.14±0.25122.7±34.6重度組241.92±0.17147.5±31.5對照組560.38±0.0810.5±2.1F組4.8698.274P組<0.01<0.01

表3各組患者AI比較

Tab 3Comparison of AI of patients in each group

指 標nAI/%t值P值TNF-α/ng·mg-1≥1.04215.34±1.36<1.07011.45±1.923.759<0.05iNOS/個·mm-2≥1004813.54±0.94<1006410.76±1.025.346<0.05

2.3TNF- α和iNOS與胃炎發病、細胞凋亡的相關性

患者TNF-α和iNOS均與胃炎發病和細胞凋亡呈正相關,差異具有統計學意義,見表4。

表4相關性分析

Tab 4Correlation analysis

指 標胃炎發病細胞凋亡r值P值r值P值TNF-α0.6950.0030.7370.006iNOS0.5380.0020.7020.005

3討論

TNF-α是由巨噬細胞、T淋巴細胞和NK細胞產生的細胞因子。機體在疾病狀態下,TNF-α等炎癥因子升高,可導致中性粒細胞移動,誘導其發生黏附及細胞穿出,干擾胃黏膜內皮細胞的功能,使血流減少,從而造成胃黏膜損傷[6]。此外,TNF-α甚至可導致氧自由基的產生,并使溶酶體破裂,引起細胞凋亡。幽門螺桿菌感染時則可引起胃黏膜組織損傷,并激發炎癥性因子TNF-α的分泌,加劇組織損傷。

一氧化氮(NO)是人體內的一種具有生物活性的分子[7],其主要來源于食物攝入的無機氮轉化和NO合酶。 iNOS可調節NO,而iNOS誘導產生的大量NO即為其產生病理作用的基礎,在多種疾病發生發展的過程扮演重要角色。大量研究[8]表明,當受到各種內外刺激因素作用后iNOS表達顯著增加,促使NO過量表達,可產生促炎促腫瘤的病理作用。研究[9- 10]發現,抑制iNOS的表達或NO的產生可有效抑制胃炎和胃癌的發生。因此,胃黏膜炎癥反應可誘導iNOS的表達,iNOS的過度表達也會誘發胃炎的發生并加重病情。

本研究結果顯示,TNF-α與iNOS水平與患者病情有一定聯系,病情越嚴重TNF-α與iNOS水平越高,表2顯示輕、中、重度組均明顯高于健康對照組。同時,胃炎患者胃黏膜細胞有明顯細胞凋亡現象。細胞凋亡是指在某些生理或病理條件下,細胞受到某種信號的觸發后主動參與并遵循一定程序的死亡過程[11]。一般情況下細胞凋亡與增殖處于動態平衡狀態,維持組織的正常結構和功能,胃黏膜上皮細胞凋亡異?？蓪е挛葛つげ∽兊陌l生[12]。本研究中胃炎患者凋亡細胞形態、大小、染色較正常細胞均有明顯不同；將患者分別按照TNF-α與iNOS水平各分為兩個亞組,發現TNF-α≥1.0 ng·mg-1時的AI顯著高于TNF-α<1.0 ng·mg-1,iNOS≥100 個·mm-2時AI顯著高于iNOS<100 個·mm-2,TNF-α和iNOS不同亞組之間AI差異均有統計學意義,P<0.05,推斷TNF-α與iNOS水平的提高可能是細胞凋亡的誘因[13]。另外,Pearson相關性分析顯示患者TNF-α和iNOS均與胃炎發病和細胞凋亡呈正相關,可見患者TNF-α和iNOS表達與胃炎發病和細胞凋亡有顯著關聯[14]。

綜上所述,胃炎患者胃黏膜的炎癥及發病可能與TNF-α和iNOS的分泌有關,TNF-α和iNOS的分泌還可能誘導胃黏膜細胞凋亡,其具體作用靶點和機制尚不明確,有待進一步研究[15]。

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Study on the relation of the expression of TNF-α,iNOS with apoptosis and gastritis

CHEN Dong

(DepartmentofEmergency,theFirstHospitalofChangshaCity,Changsha410005,China)

[Abstract]Objective： To study the relationship of the expression of TNF- α, inducible nitric oxide synthase(iNOS) and with apoptosis and gastritis. Methods: 112 patients with gastritis as a study group and 56 healthy volunteers of the same age as a control group were selected. All patients’ liver function, blood routine, blood pressure and heart rate were examined the next day in the hospital. Next, the study group was furthermore divided into 3 groups according to illness severity, the levels of TNF- α and iNOS were compared. Apoptosis was detected by TUNEL assay. Finally, Pearson correlation analysis methods were used to analyze the correlation on iNOS, TNF- α with gastritis and apoptosis. Results:(1) The more severe the disease, the higher the levels of iNOS and TNF- α would be. Moreover, both iNOS and TNF- α levels were significantly higher than those in the control group. (2) Apoptotic cells were significantly different from normal cells in morphology, size and TUNEL staining. At the same time, when TNF- α ≥1.0 ng·mg-1, AI was significantly higher than that when TNF- α<1.0 ng·mg-1. When iNOS≥100 mm-2, AI was significantly higher than that when iNOS<100 mm-2. (3) Both iNOS and TNF- α levels positively correlated with the incidence of gastritis and apoptosis with significant differences. Conclusion: Inflammatory reaction of gastric mucosa for patients with gastritis may be related to the secretion of TNF- α and iNOS and they may induce apoptosis of gastric mucosal cells.

[Key words]tumor necrosis factor α; inducible nitric oxide synthase; gastritis; apoptosis

[收稿日期]2015- 10- 12[修回日期] 2016- 02- 16

[作者簡介]陳東(1978-),男,湖南長沙人,副主任醫師,醫學碩士。E- mail:83547459@qq.com

[中圖分類號]R573.3; R329.25

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)03- 0370- 04

doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.03．017

[引文格式] 陳東.胃黏膜組織TNF-α及iNOS表達水平與胃炎發病及細胞凋亡的相關性研究 [J].東南大學學報:醫學版,2016,35(3):370- 373.

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