腸復方對裸鼠腸癌微血管密度及血管內皮生長因子的影響

梁　慧，楊　春，曾　偉，尚　姣，謝勝軍，李曉萍

( 1. 中南大學湘雅醫學院附屬腫瘤醫院，湖南 長沙 410013；2. 湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208)

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腸復方對裸鼠腸癌微血管密度及血管內皮生長因子的影響

梁慧1，楊春1，曾偉1，尚姣1，謝勝軍2，李曉萍2

( 1. 中南大學湘雅醫學院附屬腫瘤醫院，湖南 長沙 410013；2. 湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208)

[摘要]目的觀察腸復方對裸鼠結腸癌原位移植瘤微血管密度(MVD)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)的影響,探討腸復方的抑瘤機制。方法將50只采用HCT116結腸癌細胞成功建立結腸癌移植瘤模型的裸鼠隨機分為空白模型組、5-氟尿嘧啶(5-Fu)組和腸復方低、中、高劑量組，分別灌服生理鹽水、腹腔注射5-Fu、灌服相應劑量腸復方溶液，共4周。采用SABC免疫方法檢測瘤組織中MVD及VEGF的表達情況。結果與空白模型組比較，腸復方高、中、低劑量組及5-Fu組瘤組織中MVD及VEGF表達量均顯著降低(P均<0.05),其中腸復方高劑量組表達量最少(P<0.05)，腸復方對MVD及VEGF的抑制作用存在量效趨勢。結論腸復方能下調VEGF表達，從而減少瘤組織血管生成，這可能是腸復方的抑瘤機制之一。

[關鍵詞]腸復方；大腸癌；血管內皮生長因子；微血管密度；血管生成

血管生成是惡性腫瘤增殖和轉移的基礎。腫瘤血管生成受腫瘤微環境中促血管生成因子和血管生成抑制因子的動態調控,血管內皮細胞生長因子(VEGF)是已知的血管生成最重要的促進因子[1]。腫瘤代謝的微環境被改變，如缺氧、低血糖、酸性物質堆積等，導致促血管生成因子和血管生成抑制因子的失衡，腫瘤細胞VEGF 表達上調，啟動腫瘤血管生成[2]。微血管密度(MVD)是反映腫瘤血管生成的重要指標[3]，可直接反映局部組織生成血管能力和局部組織血供的多少。鑒于血管生成是腫瘤增殖和轉移的基礎, 目前通過調控VEGF的表達進而抗腫瘤血管生成是治療腫瘤的主要方向[4]。當前大腸癌的治療方法主要依賴于手術、化療、放療以及生物與靶向治療[5]，而中醫藥在降低大腸癌化療毒副反應、改善患者臨床證候、提高生存質量等方面顯示出了一定的優勢。腸復方是湖南省腫瘤醫院治療大腸癌的經驗方，能明顯抑制瘤體生長，延長患者生存期，改善患者生存質量。本實驗擬通過觀察腸復方對VEGF表達水平和瘤體MVD的影響，尋找腸復方可能的抑瘤機制。

1實驗資料

1.1實驗細胞人結腸腺癌細胞株HCT-116(編號TCHu99)，購自中科院細胞庫(上海)。

1.2實驗動物BALB/C裸鼠60只，雄性，5～6 周齡，體質量(20±2)g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(湘) 2011-0003。裸鼠在湖南師范大學醫學院動物實驗中心SPF條件下飼養并自由飲食，許可證號：SYXK(湘)2014-0006。

1.3實驗試劑胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；RPMI 1640、PBS青霉素和鏈霉素混合液、0.25%胰蛋白酶購自Hyclone 公司；DMSO 購自Sigma 公司。SABC免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋公司；鼠抗人CD31單克隆抗體和鼠抗人VEGF單克隆抗體購于沈陽萬類生物科技有限公司。二氨基聯苯胺(DAB)顯色液購自北京中杉金橋公司。

1.4實驗儀器超凈工作臺(北京亞泰隆公司)，5%CO2培養箱(上海三藤儀器公司)，倒置生物顯微鏡(北京中顯恒業儀器儀表有限公司)，5702R 型臺式低速離心機(德國Eppendorf 公司)，MD-U53V 型超低溫冰箱(日本SANYO 公司)，恒溫箱(北京市六一儀器廠)，切片機(德國萊卡)，IMS 細胞圖像分析系統(上海基爾頓生物科技有限公司)。

1.5實驗藥物中藥腸復方所需藥材購自湖南省腫瘤醫院中藥房，由黃芪、黨參、白術、薏苡仁、壁虎、土鱉蟲、白花蛇舌草等藥物組成。取藥后每200 g腸復方中藥先用清水800 mL浸泡30 min，然后武火煎沸，改文火煎1 h，提取藥液，保留藥渣再加水400 mL煎煮1 h，提取藥液，取2次藥液混合，以無菌紗布過濾，濃煎至每毫升含腸復方生藥2.6 g/mL，采用人和動物間體表面積折算的等效劑量比值表計算給藥劑量，配制2.6，1.3，0.65 g/mL濃度腸復方液，用標示好的消毒玻璃瓶保存，4 ℃ 冰箱冷藏備用。5-氟尿嘧啶注射液(5-Fu)購自上海旭東海普藥業有限公司，批號：FA141201，規格：250 mg/支。

1.6實驗方法

1.6.1大腸癌細胞懸液制備常規復蘇大腸癌HCT-116細胞，將細胞培養于含10%胎牛血清RPMI 1640 培養液中，置于37 ℃、含5%CO2的培養箱內培養并傳代， 取對數生長期的細胞，用0.25%胰蛋白酶加0.02% EDTA 的消化液消化收集，使用PBS配制成細胞密度為1×107mL-1的單細胞懸液。

1.6.2瘤源制備取制備好的大腸癌HCT-116 細胞懸液0.1 mL，注射到4只BALB/C 小鼠右腋下，10 d后可長出直徑約1 cm 的實體瘤，以此作為瘤源。

1.6.3裸鼠原位移植瘤模型建立先處死皮下瘤源小鼠，皮膚消毒，剝離皮下腫瘤，立即浸入含青霉素、鏈霉素各100 IU/mL 的生理鹽水中，剔除周圍結締組織，取腫瘤中心近邊緣處呈魚肉狀的組織，剪碎成1 mm3大小的瘤塊備用。將待造模的小鼠分別稱質量，5%水合氯醛(40 mg/kg ) 腹腔內注射麻醉后，取仰臥位，固定四肢，碘酒消毒腹部術野，左下腹部切口入腹，顯露盲結腸，用4號針頭輕輕刮去盲結腸交界處少許漿膜，有血液滲出，隨機選取1 粒已制備好的瘤塊貼于劃破處，輕輕往里推壓后于其表面滴1滴OB膠，可見瘤塊迅速粘牢(約10 s)，觀察無活動性出血后將外置腸段回納入腹，縫合腹壁。待小鼠麻醉清醒后置于清潔級動物房中常規飼養。整個操作過程遵循無菌操作原則。

1.6.4分組及干預按隨機數字表法將造模成功的50只裸鼠隨機分為空白模型組、5-Fu組和腸復方高、中、低劑量組，每組10 只。造模后第14天開始給藥干預：5-Fu組按人腹腔給藥劑量500～750 mg折算為1.5 mg/次(約0.1 mL)，腹腔注射，每周2次(周一和周四)，并予生理鹽水0.4 mL灌胃，每天1次，每周5 d；腸復方高、中、低劑量組分別予2.6，1.3，0.65 g/mL濃度腸復方藥液0.4 mL灌胃，每天1次，每周5 d，并予生理鹽水0.1 mL腹腔注射，每周2次(周一和周四)；空白模型組給予生理鹽水0.4 mL灌胃，每天1次，每周5 d，并予生理鹽水0.1 mL腹腔注射，每周2次(周一和周四)。上述干預均連續4周。

1.6.5標本處理干預4周后停藥1 d，以頸椎脫臼法處死小鼠，剖腹剝離移植瘤組織，采用10 %福爾馬林溶液固定48 h，乙醇梯度脫水、浸蠟，石蠟包埋，切片，厚度約4 μm。

1.7檢測指標

1.7.1MVD免疫組化兩步法標記CD31將各組已包埋好的腫瘤組織切片常規脫蠟水化，檸檬酸高溫修復抗原。3% H2O2去離子水孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，每次3 min。滴加鼠抗人CD31單克隆抗體，4 ℃過夜，PBS沖洗，滴加二抗37 ℃孵育20～30 min，PBS 沖洗,DAB顯色，蘇木精復染，脫水封片。光鏡下免疫組化染色呈棕黃色、淡黃色或棕褐色。在低倍鏡(×100)下確定3個血管最密集部分，再在高倍鏡(×200)下計數每個密集區中 1 個視野的微血管數，以3個區域微血管數的平均數作為MVD，在高倍鏡(×400)下拍照。

1.7.2VEGF表達情況采用免疫組化SABC法檢測，操作步驟按試劑說明書進行。將各組已包埋好的腫瘤組織切片常規脫蠟水化，檸檬酸高溫修復抗原。3%H2O2去離子水孵育 10 min，以阻斷內源性過氧化物酶。PBS洗2次，每次3 min，用濾紙吸干PBS液體后滴加5%BSA封閉液,室溫20 min,甩去多余液體,不洗。滴加鼠抗人VEGF單克隆抗體，4 ℃過夜，PBS沖洗，滴加二抗37 ℃孵育20～30 min，PBS 沖洗，擦干組織周圍的PBS后加上SABC(1∶100稀釋)，置于37 ℃溫箱中20～30 min，PBS洗后行DAB顯色，蘇木精復染，脫水封片。陽性表達位于細胞質中，呈淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒特異性分布于胞漿，顯色較好，非特異性背景染色控制良好。免疫組化結果采用Matern半定量分析方法[6],綜合染色強度及染色反應細胞分布范圍進行半定量處理。按陽性著色程度評分，無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽性細胞所占比例評分，<5%計0分， 5%～10%計1分，11%～50%計2分， 50%～80%計3分，>80%計4分。以兩者相加之和為VEGF總分。

2結果

2.1各組瘤體組織中MVD空白模型組瘤體組織內皮細胞中可見多條微血管，腸復方低、中、高劑量組及5-Fu組微血管數明顯減少，其中腸復方高劑量組微血管數最少(P均<0.05)，腸復方中劑量組與5-Fu組微血管數相當。見圖1～5。

圖1　空白模型組瘤組織CD31免疫組化染色表現(DAB，×400)

圖2　5-Fu組瘤組織CD31免疫組化染色表現(DAB，×400)

圖3　腸復方低劑量組瘤組織CD31免疫組化染色表現(DAB，×400)

2.2各組瘤體組織中VEGF表現情況VEGF主要表達于胞漿中。空白模型組VEGF呈強陽性表達，腸復方低、中、高劑量組及5-Fu組VEGF陽性表達減弱，其中腸復方高劑量組VEGF陽性表達最弱(P均<0.05)，腸復方中劑量組與5-Fu組VEGF陽性表達相似。見圖6～10。

圖4　腸復方中劑量組瘤組織CD31免疫組化染色表現(DAB，×400)

圖5　腸復方高劑量組瘤組織CD31免疫組化染色表現(DAB，×400)

圖6　空白模型組瘤組織中VEGF免疫組化染色表現(DAB，×400)

圖7　5-Fu組瘤組織中VEGF免疫組化染色表現(DAB，×400)

2.3各組原位移植瘤組織中MVD及VEGF評分比較腸復方低、中、高劑量組及5-Fu組MVD及VEGF評分均明顯少于空白模型組(P均<0.05)，其中腸復方高劑量組MVD及VEGF評分均明顯少于腸復方中、低劑量組和5-Fu組(P均<0.05)，腸復方中劑量組與5-Fu組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

3討論

大腸癌是人類最常見的消化道惡性腫瘤，已被證實腸癌的生長、浸潤、轉移與腫瘤血管生成密切相關[7]，抑制腫瘤血管生成是治療腸癌的重要策略。MVD是評估腫瘤組織血管形成狀態的重要指標，多數惡性實體腫瘤的發生、發展、轉移及患者的預后與腫瘤 MVD 密切相關[8]。VEGF是目前發現的作用最強、特異性最高的促血管生成因子[9]。VEGF 與內皮細胞血管生長因子受體結合后促進血管內皮細胞進行有絲分裂，導致內皮細胞的大量增生，從而促進新的血管生成[10]。其中VEGF-A 與其受體VEGFR-2 的特異性結合起了較大的作用，可促進內皮細胞的增殖、遷移、出芽，以及促進血管生長和增加通透性。許多實驗證實，腫瘤組織VEGF表達強度與MVD呈正相關[11]。在深入研究腫瘤微環境在腫瘤發生發展中的機制，分析其調控腫瘤生長的關鍵靶點的基礎上，探索中醫藥是否能夠以腫瘤微環境為靶點進行靶向治療，切斷腫瘤與其生長的微環境之間的關系，將會是今后研究的熱點[12]。VEGF是腫瘤微環境中重要的藥物靶點。為探討腸復方的抑瘤機制，本研究觀察了腸復方對瘤體組織中VEGF和MVD的影響，結果顯示：與空白模型組比較，腸復方高、中、低劑量組及5-Fu組瘤體組織中MVD及VEGF表達均顯著降低,腸復方對MVD及VEGF抑制作用存在量效趨勢，以高劑量組表達最低；腸復方中劑量組對MVD及VEGF的抑制作用與5-Fu組比較差異不明顯。提示腸復方可能通過下調VEGF表達，從而減少瘤組織血管生成，這可能是腸復方的抑瘤機制之一。

圖8　腸復方低劑量組瘤組織中VEGF免疫組化

圖9　腸復方中劑量組瘤組織中VEGF免疫組化

圖10　腸復方高劑量組瘤組織中VEGF免疫組化

組別nMVD/條VEGF評分/分空白模型組934.78±2.966.22±0.835-Fu組1026.17±3.75①②4.00±1.15①②腸復方低劑量組929.89±2.95①②5.11±0.78①②腸復方中劑量組1025.23±3.65①②3.90±0.99①②腸復方高劑量組1019.93±3.19①2.00±0.81①

注：①與空白模型組比較，P<0.05；②與腸復方高劑量組比較，P<0.05。

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Effect of Intestinal Compound Recipe on vascular endothelial growth factor and microvascular density in nude mice with colorectal orthotopic transplantation tumor

LIANG Hui1, YANG Chun1, ZENG Wei1, SHANG Jiao1, XIE Shengjun2, LI Xiaoping2

(1. Hunan Cancer Hospital, Changsha 410013, Hunan, China; 2. Hunan University of TCM, Changsha 410208, Hunan, China)

Abstract:Objective It is to observe the influence of Intestinal Compound Recipe (ICR) on vascular endothelial growth factor (VEGF) and microvascular density (MVD) of nude mice with colorectal orthotopic transplantation tumor, and investigate its mechanism of inhibited tumor. Methods 50 cases of colon cancer transplantation model of nude mice were successfully established by HCT116 colon cancer cells, and were randomly divided into blank model group, 5-fluorouracil (5-Fu) group, low-, medium-, high-dose ICR groups, and with ten cases in each groups. The animals in these groups were treated with administered gavages of NS, intraperitoneal injection of 5-Fu, and give the corresponding dosage of ICR to fill the stomach respectively for 4-week. The expression of VEGF and MVD in tumor tissues were detected by SABC immunization method. Results Compared with the blank model group, the expression of VEGF and MVD in the low-, medium-, high-dose ICR groups and 5-Fu group were obviously decreased (all P<0.05), the expression in the high-dose ICR group were the least (P<0.05), and the inhibitory effect of ICR on MVD and VEGF has the trend of dose effect. Conclusion ICR can down regulate the expression of VEGF, so as to reduce tumor angiogenesis, this may be one of the mechanisms of the inhibition of the intestinal compound.

Key words:colon cancer; Intestinal Compound Recipe; vascular endothelial growth factor; microvessel density; angiogenesis

[收稿日期]2015-09-15

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)15-1604-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.15.003

[基金項目]湖南省科技廳科研條件創新專項計劃項目(2012TT2034)

[作者簡介]梁慧，女，主任醫師,博士，研究方向為中西醫結合防治惡性腫瘤。