石蠟包埋胃鏡組織幽門螺桿菌菌體DNA探索性研究

薄威 王旭光 張忠 韓瑩

[摘要] 目的 探討從石蠟包埋胃鏡組織中提取幽門螺桿菌菌體DNA的方法和策略。 方法 選取2008年5月～2010年5月中國醫科大學263例胃癌術后石蠟包埋標本及2011年6月～2014年6月醫學院附屬中心醫院和沈陽醫學院附屬第二醫院206例幽門螺桿菌陽性石蠟包埋標本，利用試劑盒提取菌體DNA、PCR擴增，對擴增的結果進行統計分析。 結果 263例胃癌大體標本中， 231例檢測出隨意選取基因片段，陽性率為87.83% ；206例胃鏡標本中，194例檢測出幽門螺桿菌cagA基因，陽性率為89.81%。胃大體標本和胃鏡標本DNA提取陽性率之間比較差異無統計學意義（P>0.05）。 結論 從石蠟包埋胃鏡組織中提取幽門螺桿菌菌體DNA是高效可行的。

[關鍵詞] 石蠟包埋組織；幽門螺桿菌；DNA；基因擴增

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2016）08-0121-03

從胃癌術后石蠟包埋組織中提取人體基因組DNA已經廣泛應用于各種回顧性研究，隨著研究的深入和方法的改進，人們從石蠟包埋的少量胃鏡組織也可獲得較理想的DNA[1-3]，但國內尚未見從石蠟包埋胃鏡組織提取幽門螺桿菌菌體DNA的報道，主要是由于胃鏡組織塊本身很小，并且H.pylori主要定殖部分胃小凹和腺體內，數量少之又少，限制了對H.pylori DNA特點的深入研究。目前為分析H.pylori的DNA，人們多采用胃鏡獲取新鮮胃黏膜，隨即在培養基上進行涂抹，于體外進行細菌培養，從而獲得菌體DNA，這樣改變H.pylori生存的微環境，無形中增加了人為因素。因此，我們在從胃癌術后石蠟包埋組織中提取人體基因組DNA的研究基礎上，進行多方面嘗試從石蠟包埋的胃鏡組織中提取H.pylori DNA。

1 材料與方法

1.1 材料來源

263例胃癌術后石蠟包埋標本來自于中國醫科大學（2008～2010年），206例胃鏡石蠟包埋標本來自于沈陽醫學院附屬中心醫院和沈陽醫學院附屬第二醫院（2011～2014年）室溫保存至今。

1.2 H.pylori的HE染色及特染

206例胃鏡標本按常規方法每例標本制作切片3張，厚度為5 μm，分別進行常規HE染色、H.pylori特殊染色——吉姆薩染色（吉姆薩染色液G1010 北京索萊寶科技有限公司）和亞甲藍（MST-8027 胃幽門螺桿菌染色試劑盒邁新試劑）染色。具體方法見試劑盒。

1.3 DNA提取方法

石蠟組織提取DNA采用的是北京基因公司的試劑盒（GT pureTMFFPE tissue DNA Extraction KIT NO. 56404），胃癌術后標本，每例標本連續切10～12片，每片厚5 μm，胃鏡標本每例連續切18～20片，切片厚度為4 μm，放入1.5 mL離心管中，然后按試劑盒操作提取DNA。

1.4 PCR反應

胃癌術后標本隨機選取一對基因進行PCR擴增，上游引物5 CAA GCA GTC ATC CTT CTC TC 3； 下游引物5GCA CTT AGG GAT CCC AT GAA 3； 擴增條件94℃ 7min，94℃ 30s，54℃ 20s，72℃ 30s，72℃ 10min，40個循環，4℃保存。

胃鏡標本對H.pylori的cagA基因進行巢式PCR擴增。引物序列為cagA 1F 5 CGT TGA TAA CGA TAG GGA TAA C 3；cagA1R 5 GAT CCC CAA ATT TCT GAA AGC TCT T 3；cagA 2F 5 CGA TAG GGA TAA CAG GCA AGC TT 3；cagA1R 5 CTG AAA GCT CTT TGT GGA AGA TTC3兩次PCR反應體系均為20 μL，其中含模板DNA 2 μL、10×PCR buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、引物1.25 μL、taq酶0.2 μL，去離子水補足到20 μL。第二次PCR中DNA模版為第一次PCR產物，PCR反應條件為：95℃ 5 min，95℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 1 min，72℃ 5 min， 兩次PCR各進行30個循環。

1.5 統計學方法

采用SPSS16.0統計學軟件進行數據分析，計數資料組間比較進行χ2檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 H.pylori判定

分別進行HE染色、亞甲藍染色、吉姆薩染色，三者之一陽性，即為陽性，見封三圖10、11、12。

2.2 胃鏡標本和大體標本菌體

DNA提取的比較（χ2=0.449，P=0.45>0.05），所以大體和胃鏡標本DNA提取陽性率之間無顯著性差異。見表1。

2.3 菌體DNA的檢測

擴增產物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，FlourChem FC2紫外凝膠成像系統觀察結果（封三圖13）。胃鏡206例標本中有194例檢測出cagA條帶，檢出率為89.81%。大體263例標本中有231例檢測出隨意選取基因條帶，檢出率為87.83% 。

3 討論

每年約有900萬的胃癌新發病例，其中75%是與幽門螺桿菌（H.pylori）的感染密切相關的[4]。相關領域專家對H.pylori致病性特別是菌體 DNA的特性進行了廣泛而深入的研究[5-7]。在對菌體DNA研究時，多采用活檢胃黏膜體外菌培養的方法，雖然菌培養可以獲得高濃度和純度的菌體DNA，但菌培養是人為制造的體外環境，所以并不能完全反映H.pylori在人體內微環境的變化。那么有沒有更好的方法能替代菌培養呢？人們試想從甲醛固定-石蠟包埋（FFPE）組織中提取菌體DNA，臨床上對于石蠟包埋組織的制備多在取得新鮮組織1周內完成，這不但可以較好地表達H.pylori在人體內微環境中的生長和繁殖情況，并且可以解決在短時間內收集到大量新鮮標本的難題。但由于石蠟包埋胃鏡組織中菌體量極少，國內尚無人嘗試。我們借鑒了大量在FFPE組織中提取人體基因組DNA的經驗[8-10]，并且采用巢式PCR的方法成功地提取到菌體DNA。結果顯示應用FFPE從組織中提取菌體cagA的DNA陽性率為89.81%，這與國內宮月華[11]在體外培養中選取菌株cagA基因檢測的陽性率94.4%（101/107）的結果是相似的。在我們前期的實驗研究中，對263例福爾馬林固定的大材標本進行DNA提取，其中有231例提取得到DNA，陽性率87.83%，低于此次的石蠟包埋標本提取DNA的陽性率，但差異無統計學意義。充分說明從FFPE組織中提取菌體DNA的方法是可行的，可替代體外菌培養。

從FFPE組織中提取菌體DNA有助于追蹤長時間的腫瘤分子標志的改變，利于回顧性研究[12]。但我們對菌體DNA提取的陽性率并不是100%的，盡管在提取菌體DNA之前我們對H.pylori進行了特染，選擇了H.pylori陽性的標本。考慮的主要原因為經過石蠟包埋容易造成DNA不可逆降解、堿基與組蛋白交聯以及苯、寡聚核苷酸片段等一些PCR抑制劑的存在，這使PCR擴增成為難題[13-15]。在應用傳統PCR方法無法從FFPE組織中擴增出清晰的電泳條帶時，我們選擇兩對嵌套的引物，即應用巢式PCR后，獲得了清晰條帶，增加了可重復性，提高了特異性。另外，我們還發現其他一些策略可提高DNA產量：①在熔蠟的次數選擇兩次效果最好，次數過少蠟不能被完全溶解掉，次數過多易造成DNA的損失，而且第一次根據包埋組織石蠟的熔點的溫度不同，選擇65℃水浴融蠟2 h比較徹底。②在傾倒離心后的上清液時力度一定要溫和，因為組織很輕，力度大易造成菌體DNA的流失。③切片的厚度在4～6 μm較適宜，過厚不利于蛋白酶消化，影響DNA產量，過薄易造成人為DNA損傷。我們認為由于切片的大小不同，以切片的重量計算更加準確，每次抽提25～35 mg切片較適宜，既能充分消化又能提高DNA的產量。盡管我們在石蠟包埋組織中提取菌體DNA取得了一些成效，但是也存在著問題。如果選擇H.pylori通用引物可能陽性率會更高些。另外，如何控制菌體過少時的離心時間和轉速，避免菌體微滴流失，也尚需解決，下一步我們將擴大樣本例數進一步改進方法，總結經驗，以提高菌體DNA的陽性率。

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（收稿日期：2015-12-21）