慢性肥厚性喉炎中醫證候與iNOS及VEGF表達的相關性研究*

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慢性肥厚性喉炎中醫證候與iNOS及VEGF表達的相關性研究*

陶波謝強

（江西中醫藥大學附屬醫院南昌330006）

摘要：目的：從基因蛋白表達層次探索慢性肥厚性喉炎中醫證候本質與誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和血管內皮生長因子（VEGF）表達的相關性，確定慢性肥厚性喉炎的基本中醫證型。方法：選取慢性肥厚性喉炎血瘀型和痰濕型患者各20例分別設為血瘀組和痰濕組，另取喉癌蠟塊標本20例作為喉癌組：三組標本進行iNOS和VEGF表達檢測，同時血瘀組和喉癌組進行iNOS 和VEGF陽性反應強度定量；血瘀組和痰濕組行血液流變學檢測。結果：喉癌組的iNOS和VEGF的陽性表達率分別為100.0%和90.0%，血瘀組的iNOS和VEGF的陽性表達率分別為80.0%和60.0%，痰濕組的iNOS和VEGF的陽性表達率分別為30.0%和30.0%，三組VEGF和iNOS的表達差異具有顯著性，P＜0.05；iNOS和VEGF的表達與血液流變學指標密切相關，P＜0.01；iNOS的表達與VEGF的表達呈正相關，P＜0.05。結論：iNOS和VEGF可作為評價慢性肥厚性喉炎病情和預測其惡變的指標，血瘀證為慢性肥厚性喉炎的基本中醫證型。

關鍵詞：慢性肥厚性喉炎；血瘀證；誘導型一氧化氮合酶；血管內皮生長因子

江西省衛生廳中醫藥科研基金項目（編號：2007A100）

慢性肥厚性喉炎（Chronic Hypertrophic Laryngitis）為喉黏膜的彌漫性或局限性炎性增生肥厚，又稱慢性增生性喉炎，是耳鼻咽喉科常見病和多發病，為喉癌前病變（Laryngeal Precancerosis）的一種。該病病程長，聲音嘶啞重，中西醫保守治療療效不明顯，預后不確切，嚴重影響患者的工作與生活質量，隨著社會交往的頻繁和生活節奏的加快，其發病率有所提高。本研究從分子水平上檢測與慢性肥厚性喉炎中醫血瘀證密切相關的微觀指標，確定其基本中醫證型。現報告如下：

1　資料與試劑

1.1一般資料選取符合慢性肥厚性喉炎血瘀型和痰濕型患者各20例，病理石蠟標本分別設為血瘀組合痰濕組，另取我院病理科存檔的喉癌標本20例作為喉癌組。中醫證候診斷標準參照國家中醫藥管理局發布的《中醫辨證診斷治療標準》，西醫診斷標準參照《實用耳鼻咽喉科學》[1]。

1.2試劑即用型鼠抗人單克隆VEGF抗體，3 ml（編號MAB-0243，福州邁新生物技術開發有限公司）；兔抗人多克隆iNOS抗體，工作濃度：50~200；0.1 ml免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；即用型第二代免疫組化廣譜試劑盒（編號KIT-9901，福州邁新生物技術開發有限公司）；EDTA組織抗原修復液（編號MVS-0098，福州邁新生物技術開發有限公司）；DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司）。

2　方法

2.1實驗方法電子喉鏡下鉗取血瘀型和痰濕型慢性肥厚性喉炎標本各20例，采用10%甲醛固定，常規石蠟包埋，另取病理科存檔喉癌石蠟標本20例，將修整后的蠟塊以4 μm厚連續切片，制成石蠟切片，用于SP法（鏈霉卵白素-過氧化物酶連結法）免疫組化染色。采用免疫組化二步染色法。同時血瘀組和喉癌組喉組織標本進行iNOS和VEGF陽性反應強度定量，血瘀組和痰濕組患者進行血液流變學檢測。

2.2結果判斷iNOS和VEGF均為細胞漿著色，細胞內出現棕黃色顆粒為陽性，選擇每張切片組織和細胞形態保持完整的組織區域進行免疫組化染色判斷。在400倍顯微鏡下每張切片觀察5個視野，每個視野分別計算總細胞數及iNOS、VECF陽性的細胞數，并用圖像分析法對iNOS及VEGF的表達進行陽性反應強度定量。

2.3統計學數據處理與分析采用計算機統計軟件分析，計數資料組間比較采用χ2檢驗。各組計量資料的比較采用F檢驗，方差不齊采用秩和檢驗，檢驗水平α=0.05。比較血瘀組甲皺微循環、血液流變學與iNOS及VEGF表達的關系，采用多元相關、Logsitic回歸等分析。

3　結果

3.1 iNOS在痰濕組、血瘀組及喉癌組中的表達經統計學處理，χ2=12.381，P=0.02＜0.05，表明痰濕組、血瘀組及喉癌組中iNOS的陽性表達率有顯著性差異，其陽性率分別為30.0%、80.0%和100.0%，且呈平行遞增關系。見表1。

表1　三組iNOS陽性表達率比較[例（%）]

3.2 VEGF在痰濕組、血瘀組及喉癌組中的表達經統計學處理，χ2=7.500，P=0.024＜0.05，表明痰濕組、血瘀組及喉癌組中VEGF的陽性表達率有顯著性差異，其陽性率分別為30.0%、60.0%和90.0%，呈平行遞增關系。見表2。

表2　三組VEGF陽性表達率比較[例（%）]

3.3痰濕組、血瘀組及喉癌組iNOS表達反應程度比較經秩和檢驗，P=0.018＜0.05，表明痰濕組、血瘀組及喉癌組中iNOS的陽性表達反應程度有顯著性差異。見表3。

表3　三組iNOS表達反應程度比較[例（%）]

3.4痰濕組、血瘀組及喉癌組VEGF表達反應程度比較經秩和檢驗，P=0.024＜0.05，表明痰濕組、血瘀組及喉癌組中VEGF的陽性表達反應程度有顯著性差異。見表4。

表4　三組VEGF表達反應程度比較[例（%）]

3.5 iNOS和VEGF在痰濕組、血瘀組和喉癌組中表達的相關性分析經Spearman等級相關分析，P＜0.05，表明iNOS和VEGF在痰濕組、血瘀組及喉癌組中的表達呈正相關。見表5。

表5　iNOS和VEGF在痰濕組、血瘀組和喉癌組中表達的相關性分析

3.6痰濕組和血瘀組血液流變學指標分析經統計學分析，痰濕組和血瘀組的血液流變學指標差異顯著，P＜0.01；血瘀組各項指標明顯增高，且均高于正常值，血瘀與血液流變學之間有著內在聯系，血液流變學所表現出的濃、黏、聚狀態是血瘀證本質的客觀反映。見表6。

表6　兩組患者血液流變學檢測情況（x±s）

3.7血瘀組iNOS和VEGF表達與血液流變學指標的關系結果顯示：iNOS和VEGF的陽性與陰性表達與血液流變學指標的差異具有顯著性，P＜ 0.01，陽性表達的血液流變學各項指標明顯高于陰性表達。見表7。

表7　血瘀組iNOS和VEGF的表達與血液流變學指標的關系（x±s）

4　討論

目前，中醫對慢性肥厚性喉炎病因病機的論述甚多，但無論病因如何，最終發病的病機均為氣滯血瘀痰凝。慢性肥厚性喉炎的喉局部表現為黏膜充血暗紅肥厚、增生隆起，與中醫學的血瘀證相一致，微循環障礙為其最基本的病理改變。免疫組織化學（Immunohistochemistry）是利用抗原與抗體特異性結合的原理和特殊的標記技術，對組織和細胞內的特定抗原或抗體進行定位、定性或定量檢測的一門技術。免疫組化技術以其特異性強、敏感度高、操作簡便并且能將形態學改變與功能和代謝結合起來等優點，得到了廣泛的推廣和應用。

本研究結果顯示痰濕組、血瘀組和喉癌組VEGF和iNOS均呈不同程度的陽性表達，三組的VEGF和iNOS表達差異具有顯著性，其中喉癌組的陽性表達率最高。iNOS和VEGF的表達與血液流變學指標密切相關，據此我們可認為血瘀證為喉癌前病變的基本中醫證型。VEGF和iNOS的表達呈正相關，因此，我們認為在慢性肥厚性喉炎及喉癌的血管生成中，VEGF和iNOS兩者相互作用，不斷地促進血管新生，在喉癌的發生發展中起著重要的作用。許傳杰等[2]也通過研究證實，iNOS在喉鱗狀細胞癌中表達增高可能與血管形成有關。VEGF在體外可促進內皮細胞的生長，在體內可誘導血管發生[3~4]。iNOS和VEGF的表達可作為評價慢性肥厚性喉炎病情、預測其惡變風險的指標。因此，應重視iNOS和VEGF在血瘀型慢性肥厚性喉炎中的較高表達，提示部分細胞有惡變轉化，極易發生癌變，在病理組織學診斷前較早地提示慢性肥厚性喉炎惡變的可能。

活血化瘀治療慢性肥厚性喉炎有一定的防癌抗變療效，但因缺乏分子生物學水平的量的觀察，特別是缺少重度異型增生與癌癥難以區分的癌前病變的分子生物學水平的量的觀察，影響了活血化瘀治療癌前病變療效科學的判定。中醫藥治療癌癥療效測評的客觀化，活血化瘀方藥治療慢性肥厚性喉炎的效應與血管生成調節因子關系，以及慢性肥厚性喉炎與病變局部微血管的關系等研究，是我們今后進一步研究的重點。

參考文獻

[1]黃選兆,汪吉寶.實用耳鼻咽喉科學[M].北京:人民衛生出版社, 1998.465

[2]許傳杰,王貴全,沙春蕊,等.喉癌組織中誘導型一氧化氮合酶的表達與微血管密度的關系及其臨床意義[J].中國老年學雜志, 2004,24(2):110-111

[3]Dvorak HF,Brown LF, Detmar M,et al.Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, microvascular hyper permeability and angiogenesis [J].Am J Pathol,1995,146 (5): 1029-1039

[4]Kondo S,Asano M,Matsuo K,et al.Vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor is detectable in the sera of tumor-bearing mice and cancer patients [J].Biochim Biophys Acta, 1994,1221(2):211-214

收稿日期：（2015-04-02）

doi:10.13638/j.issn.1671-4040.2015.09.020

文獻標識碼：B

中圖分類號：R767.11

*基金項目：江西省教育廳科學技術研究項目（編號：GJJ08336）；