Eupatilin對黃嘌呤氧化酶活性抑制的實驗研究

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Eupatilin對黃嘌呤氧化酶活性抑制的實驗研究

王海東1謝建祥2林偉青1#

（1江西省人民醫院南昌330006；2江西省兒童醫院南昌330006）

摘要：目的：通過體外酶學試驗分析Eupatilin對黃嘌呤氧化酶活性的影響及抑制機理。方法：利用紫外分光光度計觀測尿酸生成導致的吸光度變化值，測定波長為292 nm，并以黃嘌呤為底物根據測定結果繪制Lineweaver-Burk和Dixon圖。結果：Eupatilin對黃嘌呤氧化酶表現很強的抑制作用，其Ki值為0.128 6 μg/ml，抑制類型為混合型；而別嘌呤醇作為對照，其Ki值為0.62 μg/ml，抑制類型為競爭性抑制。結論：Eupatilin具有明顯的黃嘌呤氧化酶抑制活性。

關鍵詞：異澤蘭黃素；黃嘌呤氧化酶；黃嘌呤；活性抑制

隨著國民經濟發展，人們飲食結構的變化及人口老齡化，近年來我國痛風發病率呈明顯上升的趨勢。現代醫學研究發現痛風的根本病因是嘌呤代謝紊亂，血（尿）中嘌呤代謝最終產物即血尿酸水平持續增高。臨床治療痛風多使用秋水仙堿、非甾體類抗炎藥、皮質類固醇、黃嘌呤氧化酶及黃嘌呤脫氫酶抑制劑等，雖然能控制癥狀，在一定程度上延緩病情，但由于對體內病理性產物缺乏清除或轉化，而且還有藥物的不良反應，所以難以達到理想的治療效果。別嘌呤醇是臨床上最常應用的黃嘌呤氧化酶及黃嘌呤脫氫酶抑制劑，但在臨床使用中發現別嘌呤醇可能導致肝炎、超敏變態反應等較為嚴重的不良反應，導致患者因害怕而依從性差，因此研究出更安全可靠的方法，發揮中醫藥的優勢，是我們面臨的一個難題。Eupatilin（異澤蘭黃素）是從一種復方制劑中提取出的藥物DA-9601的主要活性成分，在韓國已應用于護肝、抗氧化、抗炎及抗菌。本研究通過預實驗發現Eupatilin對黃嘌呤氧化酶有很強的抑制作用，并以此為基礎進行了更為詳細的體外酶學試驗，研究分析其對黃嘌呤氧化酶活性的影響。現報告如下：

1　實驗材料

1.1儀器紫外分光光度計（島津UV1800型）、R-201旋轉蒸發器（東京理化）、電子天平、876A-2型數顯真空干燥箱。

1.2試劑Eupatilin（上海純優生物科技有限公司），黃嘌呤氧化酶（sigma公司），黃嘌呤（sigma公司），別嘌呤醇（sigma公司），磷酸二氫鉀（分析純），磷酸氫二鈉（分析純）。

2　實驗方法

2.1溶液配制

2.1.1磷酸鹽緩沖液（PBS）配制精密稱取Na2HPO414.20 g和KH2PO42.72 g，加入蒸餾水配成濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液500 ml，將pH值調至7.5。

2.1.2別嘌呤醇（A）液配制精密稱取別嘌呤醇2 mg，用PBS（pH=7.5）100 ml溶解，配制成濃度為20 μg/ml的別嘌呤醇溶液備用。

2.1.3黃嘌呤（X）液配制精密稱取氫氧化鈉0.06 g，用8 ml蒸餾水溶解，得到氫氧化鈉溶液，再加入精密稱取的黃嘌呤0.057 g，即為黃嘌呤氫氧化鈉溶解液（a液）。精密稱取磷酸二氫鉀0.27 g，用10 ml蒸餾水溶解，獲得磷酸二氫鉀液（b液）。將a液、b液混合后，加蒸餾水稀釋至40 ml，再用PBS（pH=7.5）稀釋至100 ml。精密量取8 ml，加入PBS液（pH=7. 5）稀釋至66.667 ml，即得到1 mmol/L的X液。

2.1.4黃嘌呤氧化酶（XO）液配制精密量取黃嘌呤氧化酶40 μl（1 U），加PBS（pH=7.5）稀釋至2 ml，即得0.5 U/ml的XO液。

2.1.5 Eupatilin（異澤蘭黃素）液配制精密稱取1 mg Eupatilin加入50 μl二甲亞礬（DMSO）溶解后（DMSO最終濃度＜1%），再用PBS（pH= 7.5）配制成0.4 mg/ml的Eupatilin溶液備用。

2.2黃嘌呤氧化酶抑制實驗

2.2.1光密度值每分鐘變化A值測定取0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液400 μl，分別加入濃度為1 mmol/L的X液60 μl、100 μl、200 μl、300 μl、400 μl，振蕩2 min后再加入200 μl即0.1 U的黃嘌呤氧化酶溶液（已預溫至25℃）渦旋混勻后，用紫外分光光度計觀測292 nm處該反應體系在不同時間點的吸光度值，連續測定15 min，每分鐘測定1次，以時間與吸光度進行線形回歸，計算斜率Rate值（dA/min）。每個樣品重復操作3次，取其平均值。

2.2.2光密度值每分鐘變化B值測定在60 μl、100 μl、200 μl、300 μl、400 μl濃度為1 mmol/L的X液的各試管中加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液300 μl后再分別加入Eupatilin液各12.5 μl、25 μl、50 μl、100 μl；陽性對照加入別嘌呤醇液各12.5μl、25 μl、50 μl、100 μl；空白對照則加入DMSO各12.5 μl、25 μl、50 μl、100 μl，然后在每個試管中加入200 μl的XO液，各試管的總體積為1 ml。

2.2.3黃嘌呤氧化酶活性的計算以公式（1－B/A）×100%，計算黃嘌呤氧化酶活性抑制百分率。

2.2.4 Ki值計算用Dixon繪圖法計算Ki值，以樣品濃度為自變量，反應速率的倒數為因變量，在兩種不同濃度的底物下，獲得兩條直線，采用SPSS17.0統計軟件包計算回歸方程，求出兩直線交點的X軸值，即得抑制動力學參數Ki值。

3　實驗結果

3.1 Eupatilin對黃嘌呤氧化酶的抑制作用Eupatilin顯著抑制了尿酸的生成，明顯抑制了黃嘌呤氧化酶，表現為混合型抑制，并與濃度相關，與空白組對照差異性顯著，P＜0.01。見圖1。

圖1　Eupatilin對黃嘌呤氧化酶的Linweaver-Burk曲線

3.2各樣品對XO的抑制效果將各樣品濃度與平均抑制率進行線形回歸，然后根據回歸方程計算抑制率I=50%時C的值，即為半數抑制濃度IC50。見表1。

表1　各樣品對XO的抑制效果

3.3抑制動力學參數Ki值計算采用Dixon繪圖法計算Ki值：以樣品濃度為自變量，反應速率的倒數為因變量，在兩種不同濃度的底物下，得到兩直線，再用SPSS17.0統計軟件包計算回歸方程，求出兩直線交點的X軸值，即為抑制動力學參數Ki。見圖2~圖3。

圖2　黃嘌呤／黃嘌呤氧化酶體系中Eupatilin的Dixon圖

圖3　黃嘌呤／黃嘌呤氧化酶體系中別嘌呤醇的Dixon圖

4　討論

本實驗研究發現，Eupatilin能有效抑制黃嘌呤氧化酶活性，且與濃度相關，表現為混合型抑制，為進一步動物實驗及臨床研究打下了基礎。Eupatilin是中藥艾葉里提取的一種重要的黃酮類活性成分，具有治療胃潰瘍和鎮痙的作用[1~2]，在韓國已作為抗胃潰瘍藥上市，另外還具有調控血糖含量[3]、抗氧化[4]、抗炎[5]、抗腫瘤[6~7]等功能。

近年來國內外許多學者研究報道，一些植物化學成分對黃嘌呤氧化酶具有很強的抑制作用，Flemmig等[8]研究發現一種黃酮類化合物（flavone aglycone apigenin）和木犀草素（luteolin）等對黃嘌呤氧化酶的抑制作用明顯強于別嘌呤醇（其Ki值遠低于別嘌呤醇）；Arimboor等[9]發現一種提取自印度植物種子中的黃酮類化合物（Tetrahydroamentoflavone）在黃嘌呤氧化酶抑制實驗中也有著較強的黃嘌呤氧化酶抑制作用，其IC50值為92 nM，Ki值為0.982 μM，與別嘌呤醇差距不大（別嘌呤醇IC50值為100nM，Ki值為0.612 μM）；Lin等[10]報道一種二萜類化合物（sugiol）對黃嘌呤氧化酶也有明顯的抑制作用，其IC50值為（6.8±0.4）μM。下一步我們將在此基礎之上，進一步嘗試通過動物實驗及臨床研究探索其對黃嘌呤氧化酶抑制作用、藥代動力學以及藥物安全性，希望能找到更安全有效的痛風治療制劑。

參考文獻

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Study on Inhibitory Effect of Eupatilin on Xanthine Oxidase Activity

WANG Hai-dong1, XIE Jian-xiang2, LIN Wei-qing1#(1The People’s Hospital of Jiangxi Province, Nanchang330006; 2The Children’s Hospital of Jiangxi Province, Nanchang330006)

Abstract:Objective: To research the influence and inhibitory mechanism of Eupatilin on the activity of Xanthine Oxidase by vitro enzymatic test. Methods: Determined the absorbance changes caused by the formation of uric acid value by using UV spectrophotometer, the detection wavelength was 292 nm, according to the measured results, draw the Lineweaver Burk and Dixon plots with Xanthine as substrate. Results: Eupatilin had strong inhibition on Xanthine Oxidase, the Ki value was 0.128 6 μg/ml, the type of inhibition is of mixed type; and with Allopurinol as a reference, the Ki value was 0.62 μg/ml, the type of inhibition was competitive inhibition. Conclusion: Eupatilin has the obvious inhibitory activity of Xanthine Oxidase.

Key words:Eupatilin; Xanthine oxidase (XO); Xanthine; Inhibitory effect

收稿日期：（2015-03-23）

doi:10.13638/j.issn.1671-4040.2015.09.054

文獻標識碼：B

中圖分類號：R285.5