下調(diào)VEGF基因表達對人大腸癌細胞株SW480的增殖抑制作用

下調(diào)VEGF基因表達對人大腸癌細胞株SW480的增殖抑制作用

孫鵬達劉天舟孫冬

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林長春130041)

摘要〔〕目的利用RNA干擾技術(shù)特異性抑制人大腸癌細胞株SW480的VEGF基因表達，并進行大腸癌的基因治療。方法體外合成帶有T7啟動子的VEGF基因DNA片段、轉(zhuǎn)錄針對VEGF mRNA的siRNA、利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入SW480細胞內(nèi)，MTT染色法觀察轉(zhuǎn)染后的SW480細胞增殖抑制率，ELISA法檢測蛋白表達水平。RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后VEGF mRNA表達水平的變化。結(jié)果設(shè)計的兩個靶位點siRNA能有效抑制SW480細胞生長，VEGF mRNAR 的表達受到有效抑制，而陰性對照的錯義序列組siRNA細胞生長良好。結(jié)論體外合成的VEGF siRNA可有效抑制SW480細胞增殖和VEGF mRNA蛋白表達水平。

關(guān)鍵詞〔〕siRNA；SW480細胞；血管內(nèi)皮生長因子；基因治療

中圖分類號〔〕R392.11〔文獻標識碼〕A〔

通訊作者：孫冬(1979-)，女，講師，碩士，主要從事消化系統(tǒng)疾病研究。

第一作者：孫鵬達(1976-)，男，主治醫(yī)師，在讀博士后，主要從事胃腸腫瘤診治研究。

近年研究表明血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在多種腫瘤組織中呈高表達，其中VEGF165表達較高，VEGF在血管生成信號途徑中起著關(guān)鍵的促進作用〔1〕。抑制VEGF基因表達，就可阻止腫瘤細胞的生長，故本研究應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)觀察其對人大腸癌細胞株(SW480)細胞的增殖抑制作用，旨在為人大腸癌的基因治療提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料人大腸癌細胞株SW480細胞由吉林省腫瘤研究所惠贈；Lipofectamine TM2000、TRIzol rengent、RPMI1640、培養(yǎng)基等購自Invitrogen，T7ribomax TM Express RNAI，Systen 購自Promege。人VEGF ELISA Kit購自武漢博士德生物工程有限公司，胎牛血清購自長春生物制品研究所，噻唑藍(MTT)試劑購美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1siRNA的制備從GenBank中獲取已知的人VEGF mRNA序列(ACCESSION：ABO 21221)，采用Promega在線siRNA設(shè)計工具設(shè)計兩組siRNA序列(每組中第一條鏈為正義鏈，第二條為反義鏈)和錯義序列組SCR序列作為陰性對照，體外轉(zhuǎn)錄出來的siRNA分別標記為siRNA1，siRNA2，siRNASCR。

siRNA1：5′-GAUCAAACCUCACCAAGGCUU-3′，5′-GCCUUGGUGAGGUUUGAUCUU-3′；siRNA2：5′-GGAGUACCCUGAUG-AGAUCUU-3′，5′-GAUCUCAUCAGGGUACUCCUU-3′；siRNASC-R：5′-GCGUAACGCGGGAAUUUACUU-3′，5′-GUAAAUUCCCGC-GUUACGCUU-3′。所有siRNA都通過T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄法，具體操作參照Promega T7 RiboMAXTm Express RNAI Syste試劑盒方案。

1.2.2細胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染取2×104/ml SW480細胞加入到24孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1 ml，進行siRAN染，siRNA轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體包裹的方式〔2〕，siRNA1，siRNA2分別設(shè)立200、400、800 nmol/L 3個濃度梯度，siRNA1，siRNA2共用一套對照組，對照組除正常細胞換液外不加任何試劑，實驗重復(fù)3次。

1.2.3MTT法檢測SW480細胞增殖抑制率取轉(zhuǎn)染siRNA的SW480細胞，于結(jié)束前6 h分別加入MTT試劑100 μl/孔，終濃度為500 ng/L繼續(xù)培養(yǎng)6 h后加入二甲基亞砜(DMSO)100 μl/孔，振蕩10 min，使MTT還原產(chǎn)物完全溶解，于酶標儀570 nm處測量各孔吸光度A值按下列公式計算SW480細胞增殖抑制率。SW480細胞抑制率=(1-實驗孔細胞A值÷對照孔細胞A值)×100%。

1.2.4VEGF基因表達分析取轉(zhuǎn)染siRNASW480細胞應(yīng)用TRIZOL法提取各組細胞總RNA，采用1 μg總RNA進行RT-PCR檢測。VEGF引物：上游：5′-AATCGAGACCCTGGTGGACA-3′，下游：5′-TTAACTCAAGCTGCCTCGCC-3′，內(nèi)參照甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPTH)引物上游：5′-CGTGGAAGGACTCATGACCA-3′，下游：5′-TCCAGGGGTCTTACTCCTTG-3′。反應(yīng)體系體積為50 μl，然后按著Promega“Access RT-PCR Introductory System”試劑盒方案：45℃ 45 min進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為94℃ 2 min逆轉(zhuǎn)錄病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶滅活和RNA/CDNA引物預(yù)變性，94℃ 30 s，52.5℃ 1 min，68℃ 2 min，共40個循環(huán)，最后68℃延伸7 min，RT-PCR產(chǎn)物應(yīng)用2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠紫外攝像，光密度掃描，計算實驗組與其對應(yīng)的內(nèi)參RT-PCR產(chǎn)物比值進行比較分析。

1.2.5VEGF蛋白分泌量分析取轉(zhuǎn)染24 h后的SW480細胞上清液用于檢測VEGF蛋白分泌量，嚴格按照試劑說明操作，將不同濃度的VEGF標準品(7.8，15.6，31.2，62.5，125，250，500，1 000 pg/ml)以及不同組的細胞上清液于Rayto2100C酶標儀中檢測450 nm吸光度值和上清￥VEGF吸光度值，計算VEGF含量。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS11.0軟件行t檢驗。

2結(jié)果

2.1siRNA轉(zhuǎn)染24 h后SW480細胞增殖變化轉(zhuǎn)染后24 h各組SW480細胞的增殖有明顯的變化，與脂質(zhì)體對照相比SW480細胞明顯減少。見圖1。

2.2MTT比色法結(jié)果siRNA1組、siRNA2組與脂質(zhì)體組及正常對照組相比吸光度有明顯差異(0.97±0.21、0.86±0.24、1.48±0.13、1.51±0.11，均P<0.05)，而脂質(zhì)體組與正常對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。siRNA1組、siRNA2組抑制率分別為34.05%，43.3%。

2.3siRNA組轉(zhuǎn)染后24 h各組SW480細胞VEGF mRNA表達變化電泳結(jié)果表明siRNA1組、siRNA2與正常對照組及錯義序列組VEGF mRNA表達水平明顯降低，與細胞增殖實驗結(jié)果相符。見圖2。

2.4ELISA法檢測siRNA轉(zhuǎn)染后24 h各組SW480細胞上清液中VEGF蛋白分泌量的變化siRNA1和siRNA2組VEGF分泌量〔(172.11±29.02)、(161.34±31.24)pg/ml〕明顯低于脂質(zhì)體組〔(345.33±27.25)pg/ml〕及正常對照組〔(359.46±32.31)pg/ml〕組間比較差異顯著。

圖1　siRNA轉(zhuǎn)染24 h后SW480細胞增殖變化

1.siRNA1組；2.siRNA2組；3.脂質(zhì)體組；4.正常對照組 圖2　siRNA轉(zhuǎn)染后24 h各組SW480細胞 VEGF mRNA表達水平

3討論

近年來，結(jié)直腸癌治療技術(shù)有了很大的發(fā)展，但是單純手術(shù)治療效果仍難讓人滿意，局部復(fù)發(fā)率高達15%～50%〔3〕。因此，許多學(xué)者從腫瘤分子生物學(xué)角度對結(jié)直腸癌基因治療進行了研究，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中VEGF含量異常表達，與腫瘤侵襲復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤如果沒有新生血管的支持，當腫瘤體積達到1 mm3時就會停止生長并發(fā)生退化〔4〕。因此，抑制VEGF的表達，就可以阻止腫瘤的生長，RNAi作為生命科學(xué)領(lǐng)域的新技術(shù)，其應(yīng)用非常廣〔5〕。

本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建合成了針對VEGF的siRNA真核表達載體并把基因轉(zhuǎn)染至SW480細胞內(nèi)，結(jié)果顯示，無論是從mRNA水平，還是蛋白質(zhì)水平，都對VEGF基因的表達發(fā)揮出明顯的抑制效果，并且抑制SW480細胞的增殖。

本研究結(jié)果表明，siRNA轉(zhuǎn)染至SW480細胞后VEGF mRNA蛋白表達受到抑制，從而誘發(fā)了癌細胞的凋亡及增殖抑制，而且該表達載體能夠在哺乳動物細胞中穩(wěn)定的抑制目的基因的表達，可引起基因沉默〔6〕。此外，由于構(gòu)建的質(zhì)粒可以復(fù)制擴增，易于標準化生產(chǎn)，遠優(yōu)于化學(xué)合成法。

4參考文獻

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〔2014-09-17修回〕

(編輯袁左鳴)