十全大補(bǔ)湯含藥血清對(duì)A549和A549/DDP細(xì)胞株順鉑耐藥性及凋亡的影響

十全大補(bǔ)湯含藥血清對(duì)A549和A549/DDP細(xì)胞株順鉑耐藥性及凋亡的影響

高原陳奇1于寧2張洪源2敬一夫2關(guān)蕊2田子鶴2張城城2李春暉2

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，遼寧沈陽(yáng)110847)

摘要〔〕目的研究十全大補(bǔ)湯含藥血清對(duì)人肺腺癌順鉑(DDP)敏感細(xì)胞株A549和耐藥細(xì)胞株A549/DDP耐藥性及凋亡的影響。方法將24只SD大鼠隨機(jī)分為十全大補(bǔ)湯含藥血清低劑量組(1.625 g/ml)、中劑量組(3.25 g/ml)、高劑量組(6.5 g/ml)、空白血清組(等體積生理鹽水)，每天灌胃給藥1次，連續(xù)7 d后提取血清；MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞對(duì)DDP的半數(shù)抑制濃度(IC50)值，并計(jì)算耐藥指數(shù)；Annexin Ⅴ/PI法檢測(cè)各組細(xì)胞的早期凋亡率。結(jié)果A549細(xì)胞中，中、高劑量組IC50值均較空白血清組下降(均P<0.01)，而中劑量組的IC50值與高劑量組無(wú)差別，但較低劑量組顯著降低(P<0.05)；A549/DDP細(xì)胞中，低、中、高劑量組的IC50值均較空白血清組下降(均P<0.01)，而中劑量組IC50值與高劑量組無(wú)差別，但較低劑量組顯著降低(P<0.01)；DDP處理A549細(xì)胞后，中、高劑量組分別增加細(xì)胞的早期凋亡率(P<0.05，P<0.01)，中、高劑量組之間無(wú)差別(P>0.05)，但中劑量組較低劑量組增加細(xì)胞的早期凋亡率(P<0.05)；DDP處理A549/DDP細(xì)胞后，低、中、高劑量組均增加細(xì)胞的早期凋亡率(P<0.05，P<0.01)，但中、高劑量組之間無(wú)差別，而中劑量組較低劑量組增加細(xì)胞的早期凋亡率(P<0.05)。結(jié)論十全大補(bǔ)湯含藥血清對(duì)A549及A549/DDP細(xì)胞均有降低DDP耐藥性的協(xié)同增效作用，可能與其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)；在A549/DDP細(xì)胞中十全大補(bǔ)湯含藥血清的協(xié)同增效作用更強(qiáng)，且中劑量含藥血清效率最高、效果最佳。

關(guān)鍵詞〔〕肺腺癌；十全大補(bǔ)湯；化療耐藥；細(xì)胞凋亡

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R273〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81403303)；遼寧省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(L2012333)；中國(guó)博士后科學(xué)基金(2014M551122)

1遼寧省體育科學(xué)研究所生理研究室

2遼寧中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院

第一作者：高原(1980-)，女，博士，副教授，主要從事中藥調(diào)節(jié)腫瘤耐藥作用及其機(jī)制的研究。

Effect of serum containing Shiquan Dabu decoction on cisplatin-resistance and apoptosis of A549 and A549/DDP cells

GAO Yuan, CHEN Qi, YU Ning,etal.

Department of Pathology, Liaoning University of Chinese Traditional Medicine, Shenyang 110847, Liaoning, China

Abstract【】ObjectiveTo explore the effect of serum containing Shiquan Dabu decoction on cisplatin(DDP)-resistance and apoptosis of lung adenocarcinoma line A549, and its DDP-resistant subline A549/DDP.Methods24 SD rats were divided into low dose (1.625 g/ml)，moderate dose (3.25 g/ml) and high dose (6.5 g/ml) groups of Shiquan Dabu decoction and blank serum group (isometric normal saline). MTT assay was used to determine IC50 values of DDP. Annexin Ⅴ/PI staining method was used to detect early apoptosis.ResultsIn A549 cells, IC50 in moderate and high dose groups were lower than those of blank serum group (all P<0.01), there was no difference between moderate and high dose groups(P>0.05); however, IC50 in moderate group was lower than those of low dose group(P<0.05). In A549/DDP cells, IC50 in low, moderate and high dose groups were lower than that of blank serum group (all P<0.01), there was no difference between moderate and high dose groups(P>0.05), however, IC50 in moderate group was lower than that of low dose group (P<0.01). In A549 cells, the early apoptosis rate in moderate and high dose groups were higher than those of blank serum group(P<0.05，P<0.01), there was no difference between in moderate and high dose groups (P>0.05), however, the early apoptosis rate in middle group was higher than that of low dose group (P<0.05). In A549/DDP cells, the early apoptosis rate in low, moderate and high dose groups were higher than those of blank serum group (P<0.05，P<0.01), there was no difference between in moderate and high dose groups (P>0.05), however, the early apoptosis rate in moderate group was higher than that of low dose group (P<0.01).ConclusionsThe serum containing Shiquan Dabu decoction moderately have the synergistic effect of cisplatin-resistance on A549 and A549/DDP cells through promoting the apoptosis, and moderate dose has the best advantage.

【Key words】Lung adenocarcinoma; Shiquan Dabu decoction; Chemotheraphy resistance; Apoptosis

十全大補(bǔ)湯是益氣補(bǔ)血、扶正固本的經(jīng)典方，由四君子湯、四物湯加黃芪、肉桂組成。已有研究發(fā)現(xiàn)，十全大補(bǔ)湯可以抑制腫瘤生長(zhǎng)、抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能、降低化療藥物對(duì)機(jī)體的損傷等〔1～3〕。本實(shí)驗(yàn)擬觀察十全大補(bǔ)湯含藥血清對(duì)A549和A549/順鉑(DDP)細(xì)胞株耐藥性及凋亡的影響。

1材料與方法

1.1細(xì)胞株及動(dòng)物A549細(xì)胞株由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)病理教研室提供，A549/DDP細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。SD大鼠由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄各半，體重190～230 g，許可證號(hào)：SCXK(遼)2013-0010。

1.2中藥及制備十全大補(bǔ)湯根據(jù)《方劑學(xué)》(中國(guó)中醫(yī)藥出版社，鄧中甲主編)中規(guī)定用藥及臨床常用劑量(人參6 g，肉桂3 g，川芎6 g，熟地黃12 g，茯苓9 g，白術(shù)9 g，甘草3 g，黃芪12 g，當(dāng)歸9 g，白芍9 g)，全部藥材購(gòu)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，并通過(guò)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室的鑒定，加水浸泡30 min后，按湯劑常規(guī)方法煎熬，過(guò)濾并濃縮成生藥量含量為10 g/ml的藥液，冷卻后裝入滅菌藥瓶，4℃保存。

1.3試劑DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；胰蛋白酶、DMSO購(gòu)自韓國(guó)BIOSHARP公司；DDP購(gòu)自德國(guó)Calbiochem公司(Lot#D00117683)；MTT檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；Annexin V/PI檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京四正柏公司。

貓作為我們最常見(jiàn)的貓科動(dòng)物，已經(jīng)被人類(lèi)馴化了三千多年。在表示親密時(shí)，它常會(huì)蹭人類(lèi)的臉頰。這是因?yàn)樨埖哪橆a、耳朵、下巴跟腹側(cè)，都分布著費(fèi)洛蒙氣味腺，其中臉頰部位分泌出來(lái)的費(fèi)洛蒙，是它感到安心舒適時(shí)才會(huì)釋放的。它會(huì)將這種氣味蹭在喜歡的地方作為標(biāo)記。

1.4含藥血清的制備清潔級(jí)SD大鼠24只按隨機(jī)數(shù)字表法分為十全大補(bǔ)湯含藥血清低劑量組(1.625 g/ml)、中劑量組(3.25 g/ml)、高劑量組(6.5 g/ml)、空白血清組(等體積生理鹽水)。每組每天灌胃給藥1次，每次1 ml，連續(xù)給藥7 d，末次給藥1 h后，腹主動(dòng)脈采血置于無(wú)菌管中，37℃水浴30 min，3 000 r/min離心10 min后取上清，再重復(fù)離心2次，56℃水浴滅活30 min，0.22 μm濾器濾過(guò)除菌，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5%CO2的孵育條件下，A549細(xì)胞和A549/DDP細(xì)胞分別在含有10%胎牛血清(或10%含藥血清)的DMEM和RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，用0.25%的胰酶消化傳代。

1.6MTT法檢測(cè)十全大補(bǔ)湯含藥血清對(duì)DDP半數(shù)抑制濃度(IC50)的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和A549/DDP細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液5×103/ml，接種于96孔板中，每孔100 μl，待細(xì)胞貼壁后分組：10%含藥血清低、中、高劑量組、10%空白血清組，加入含不同血清的培養(yǎng)基100 μl，每組設(shè)立6個(gè)平行對(duì)照，并設(shè)空白對(duì)照(不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液，用于比色調(diào)零)，置正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。24 h后用2、4、8、16、32、64、128 μmol/L DDP處理細(xì)胞，37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)48 h，實(shí)驗(yàn)終止前，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，孵育4 h，棄去培養(yǎng)基，加入150 μl DMSO，振蕩10 min后，置于酶標(biāo)自動(dòng)分析儀，在570 nm波長(zhǎng)測(cè)定光吸收值(OD值)。計(jì)算IC50值，并按以下公式計(jì)算耐藥指數(shù)：耐藥指數(shù)=A549/DDP細(xì)胞IC50值/A549細(xì)胞IC50值。

1.7Annexin Ⅴ/PI法檢測(cè)十全大補(bǔ)湯含藥血清對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549和A549/DDP細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液106/ml，接種于6孔板中，每孔1 000 μl，待細(xì)胞貼壁后分組(同MTT法)，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后用20 μmol/L DDP處理細(xì)胞〔4〕，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，胰酶消化收集于1.5 ml離心管內(nèi)。用預(yù)冷4℃無(wú)菌的PBS充分洗滌細(xì)胞2次，取總數(shù)1×106/ml的細(xì)胞待檢測(cè)。用250 μl結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞并使其濃度為(2～5)×105/ml。取195 μl的細(xì)胞懸液加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC，輕輕混勻后間隔3 min再加入10 μl濃度為20 μg/ml的碘化丙錠溶液。混勻后于室溫避光孵育10 min。加300 μl結(jié)合緩沖液，輕輕混勻，上流式細(xì)胞儀(FACS)進(jìn)行檢測(cè)分析。

2結(jié)果

2.1十全大補(bǔ)湯含藥血清對(duì)A549和A549/DDP細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響倒置顯微鏡顯示，空白血清組的A549細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，成簇生長(zhǎng)，折光性較弱；而A549/DDP細(xì)胞略呈三角形，較A549細(xì)胞形態(tài)飽滿(mǎn)，成簇生長(zhǎng)，折光性較弱；經(jīng)DDP處理后，空白血清組、十全大補(bǔ)湯含藥血清低劑量組細(xì)胞均明顯變狹窄，突起增多，稀疏生長(zhǎng)，或呈圓形懸浮狀態(tài)，折光性較強(qiáng)；而經(jīng)DDP處理后，十全大補(bǔ)湯含藥血清中、高劑量組兩種細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或三角形，成簇生長(zhǎng)較明顯。

2.2A549和A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性DDP對(duì)A549和A549/DDP細(xì)胞的IC50值分別為(5.888±0.338)μmol/L和(28.984±1.404)μmol/L，耐藥指數(shù)為4.92。

2.4十全大補(bǔ)湯含藥血清對(duì)A549和A549/DDP細(xì)胞凋亡的影響DDP處理A549細(xì)胞后早期凋亡率為(39.38±0.88)%，DDP聯(lián)合中、高劑量含藥血清處理分別增加細(xì)胞的早期凋亡率〔(40.64±0.35)%,(41.59±0.42)%〕(P<0.05，P<0.01)，但中、高劑量之間無(wú)差別，而DDP聯(lián)合低劑量含藥血清處理后細(xì)胞的早期凋亡率〔(39.48±0.56)%〕與空白血清無(wú)明顯差異，但DDP聯(lián)合中劑量含藥血清較低劑量含藥血清處理增加細(xì)胞的早期凋亡率(P<0.05)。DDP處理A549/DDP細(xì)胞后早期凋亡率為(21.75±0.96)%，DDP聯(lián)合低、中、高劑量含藥血清處理均增加細(xì)胞的早期凋亡率〔(23.03±0.20)%,(24.35±0.38)%,(25.41±0.61)%〕(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，但中、高劑量之間無(wú)差別，而DDP聯(lián)合中劑量含藥血清較低劑量含藥血清處理增加細(xì)胞的早期凋亡率(P<0.05)。

3討論

目前，西醫(yī)治療肺癌主要采取手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)藥物治療及免疫(生物)治療，但因?yàn)榉伟┏霈F(xiàn)較晚且不易早期發(fā)現(xiàn)，80%～90%的中、晚期患者確診時(shí)已存在著不同程度的癌細(xì)胞播散，常已失去手術(shù)根治的機(jī)會(huì)，只能行化療；但因腫瘤較大，多數(shù)僅有姑息效果，遠(yuǎn)期療效甚微。導(dǎo)致化療失敗的重要原因是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥。鉑類(lèi)藥物是肺癌聯(lián)合化療的核心，DDP是當(dāng)前對(duì)肺癌患者單制劑化療及聯(lián)合化療效率較高的藥物之一。文獻(xiàn)報(bào)道十全大補(bǔ)湯可協(xié)同順鉑的藥效并減輕腫瘤患者的化療反應(yīng)〔5〕。

現(xiàn)代臨床及實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)，順鉑多會(huì)引起不同程度的骨髓抑制和消化道反應(yīng)，在癥狀上主要表現(xiàn)為虛羸少氣、畏寒肢冷、食少納差等〔6〕，屬中醫(yī)“氣血虧虛”范疇。其病因主要是正虛邪實(shí)、藥毒攻伐所致。病機(jī)為毒邪久滯、氣血不暢、積聚成瘀，引起氣血阻滯，正氣耗傷。化療藥物破積消癰，類(lèi)似中醫(yī)“消法”，但攻伐太過(guò)，損傷脾胃，胃失受納，脾失健運(yùn)，氣血生成不足。十全大補(bǔ)湯出自宋代《太平惠民和劑局方》，由四君子湯(人參、茯苓、白術(shù)、甘草)、四物湯(當(dāng)歸、熟地、川芎、白芍)加黃芪、肉桂組成，為氣血雙補(bǔ)的經(jīng)典名方。《太平惠民和劑局方》記載：“十全大補(bǔ)湯治男子、婦人諸虛不足，五勞七傷，不進(jìn)飲食，久病虛損，……一切病后氣不如舊，……喘咳中滿(mǎn)，脾腎氣弱，五心煩悶，并皆治之。”其中人參、黃芪、熟地為主，甘溫益氣養(yǎng)血；輔以白術(shù)健脾燥濕，茯苓健脾滲濕，二藥協(xié)人參、黃芪補(bǔ)脾肺之氣，實(shí)后天氣血生化之源；當(dāng)歸、白芍養(yǎng)血和營(yíng)，協(xié)熟地以益心調(diào)肝生血，炙甘草和中益氣，調(diào)和諸藥；川芎活血行氣，使補(bǔ)而不滯；肉桂補(bǔ)腎助陽(yáng)，振奮陽(yáng)氣，鼓舞氣血生長(zhǎng)；姜棗可調(diào)和脾胃〔7〕。

本研究中低、中、高劑量十全大補(bǔ)湯都有增強(qiáng)A549/DDP細(xì)胞DDP化療效果的作用，可能與它們促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。較低劑量的含藥血清即可對(duì)A549/DDP細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同增效作用，而較高劑量的含藥血清才對(duì)A549細(xì)胞起效，我們推測(cè)十全大補(bǔ)湯含藥血清對(duì)DDP耐藥細(xì)胞株的作用強(qiáng)于DDP敏感細(xì)胞株。同時(shí)，中劑量十全大補(bǔ)湯含藥血清對(duì)兩種細(xì)胞DDP化療的協(xié)同增效作用與高劑量相當(dāng)，而中劑量含藥血清對(duì)兩種細(xì)胞在降低耐藥性和促進(jìn)凋亡的作用上強(qiáng)于低劑量含藥血清。因此，中劑量十全大補(bǔ)湯含藥血清對(duì)DDP化療的協(xié)同增效作用效率最高、效果最佳。

4參考文獻(xiàn)

1郭剛，許建華.十全大補(bǔ)湯抑制腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的研究概述〔J〕.環(huán)球中醫(yī)藥，2011；4(1)：74-6.

2郭剛，許建華，韓建宏，等.十全大補(bǔ)湯對(duì)荷瘤小鼠結(jié)腸癌原發(fā)腫瘤切除后轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)及血管生成的影響〔J〕.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2012；10(4)：436-47.

3張永軍，包素珍，張愛(ài)琴，等.十全大補(bǔ)湯促進(jìn)小鼠與瘤共存的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2009；27(6)：1308-10.

4Gao Y，Liu Z，Zhang X，etal.Inhibition of cytoplasmic GSK-3β increases cisplatin resistance through activation of Wnt/β-catenin signaling in A549/DDP cells〔J〕.Cancer Lett，2013；336(2):231-9.

5韓艷梅，曹志然，王曉輝，等.十全大補(bǔ)湯對(duì)移植乳腺癌小鼠化療的減毒增效作用〔J〕.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2007；28(5)：358-9.

6潘乃群，許元.順鉑所致不良反應(yīng)〔J〕.中國(guó)誤診學(xué)雜志，2009；9(7)：1756.

7陳奇.中成藥名方藥理與臨床〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，1998：19-37.

〔2014-10-20修回〕

(編輯李相軍)