支氣管哮喘兒童的IL－17F基因突變分析

趙宏霞，劉 瑜，莊哈娜

（南方醫科大學附屬深圳婦幼保健院兒內科，廣東深圳518028）

支氣管哮喘兒童的IL－17F基因突變分析

趙宏霞＊，劉 瑜，莊哈娜

（南方醫科大學附屬深圳婦幼保健院兒內科，廣東深圳518028）

目的探討白細胞介素－17F基因多態性與兒童支氣管哮喘的相關性，為支氣管哮喘的易感基因篩選提供可能的理論依據。方法取本院門診隨診的60例哮喘患兒設為哮喘組，60例健康兒童設為對照組，兩組兒童均于清晨空腹留取外周靜脈血2ml，提取全基因組DNA，應用聚合酶鏈反應及克隆、基因測序方法分析IL－17F基因序列rs763780（H161R）基因多態性。結果IL－17F基因序列rs763780（H161R）基因型在兩組內均未檢測到突變型CC，rs763780（H161R）基因型（TC／TT）在兩組間內的分布有明顯的差異（χ2＝5.71，P＜0.05）。TC基因型OR和95%可信區間（CI）為2.09（1.12－3.90），TT基因型OR和95%CI為0.76（0.60－0.95）。結論IL－17F基因多態性rs763780（H161R）基因型分布（TC／TT）在兩組間存在差異，其多態性可能與哮喘相關，兩組內均未發現基因型CC在，基因型TC可能是哮喘發病的危險因素。

哮喘；IL－17F基因；突變；DNA序列分析

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1649）

支氣管哮喘是由嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T細胞、氣道上皮細胞等多種炎性細胞共同參與，以氣流受限、氣道重塑為特征的氣道炎癥性疾病，在世界范圍內其發病率呈逐年增高的趨勢，每年因哮喘而死亡的病人數高達10萬人，造成巨大的社會負擔。支氣管哮喘的防治已成為當今世界共同關注的公共健康問題［1、2］。

遺傳及環境因素在哮喘中發揮著重要作用，隨著遺傳學的不斷發展，有關哮喘遺傳易感性的研究引起了人們廣泛的興趣。目前發現有超過100個基因與哮喘相關。近年來，IL－17F基因多態性rs763780與哮喘的關聯性也引起了學者的關注。最新研究顯示在日本人群中rs763780（H161R）基因多態性（TC／CC）與哮喘的發病相關［3］，韓國學者Eun－Heui Jin等研究發現啟動序列rs1889570基因多態性與哮喘易感性有關［4］，Ramsey CD等研究非裔和歐裔美國女性包括rs763780在內的50個SNPs未發現與哮喘相關［5］。目前國內外對于rs763780（H161R）基因突變與支氣管哮喘的相關性研究得出一致結論的報道較少。

本實驗擬應用DNA測序法對哮喘兒童及健康兒童IL－17Frs1889570基因多態性檢測分析，探討IL－17Frs1889570基因多態性與兒童支氣管哮喘的相關性，為支氣管哮喘的發病易感基因篩選提供可能的理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象及分組

①哮喘組：2011年3月－2012年10月于本院門診隨診的60例哮喘患兒，男38例，女22例，年齡2－15歲，平均5.3歲。均符合2008年中華醫學會兒科學會呼吸學組制定的兒童支氣管哮喘診斷標準。

②對照組：2012年3月到2012年10月于本院健康體檢兒童60例，男36例，女24例；年齡2－14歲，平均5.2歲。

③兩組兒童組間性別、年齡差異無統計學意義，家長均知情同意參加該研究。

1.2 標本采集

哮喘組及對照組兒童均于清晨空腹留取外周靜脈血2ml，提取全基因組DNA，－20℃冰箱凍存備檢。

1.3 IL－17F序列rs763780（H161R）基因多態性檢測

1.3.1 全血基因組DNA的提取 采用苯酚／氯仿提取法，具體步驟按試劑說明操作。

1.3.2 rs763780目的基因的擴增 ①引物設計及合成：根據Genebank中rs763780（H161R）基因的序列，由上海生工生物工程技術服務有限公司在DNA自動合成儀上合成，經變性聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）純化。引物名稱、序列和預計等位基因片段大小等見表1。②PCR反應體系和條件按常規進行操作。

表1 引物名稱及序列

1.3.3 擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測 取PCR反應液10μl，加入3μl溴酚蘭液，充分混勻，加入凝膠加樣孔中。接通電源，100V恒壓電泳約30min。將凝膠板放在紫外透射儀的石英玻璃臺上進行檢測，判斷產物的存在。

1.3.4 目的基因測序將得到的PCR擴增產物送至上海生工生物工程技術有限公司進行雙向測序分析。

1.4 統計學處理

計量資料采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。用SPSS 13.0進行統計分析，P＜0.05作為差異有顯著意義的檢驗標準。

2 結果

2.1 IL－17F基因序列rs763780（H161R）基因型分為野生型TT，突變型TC、CC，突變型CC在哮喘組和對照組均未檢測到，rs763780（H161R）基因型野生型TT，突變型TC在哮喘組和對照組內的分布有明顯的差異（χ2＝5.71，P＜0.05）。見表2。

2.2 TC基因型OR和95%可信區間（CI）為2.09（1.12－3.90），TT基因型OR和95%CI為0.76（0.60－0.95）。

表2 哮喘組與正常組IL－17F（H161R）基因型比較

3 討論

研究發現哮喘病人經過敏原刺激后IL－17基因表達上調［6］，在哮喘動物模型也證實了IL－17F能增強抗原誘導的過敏性炎癥反應［7］，Chen J等證實了IL－17G－152A與兒童哮喘及肺部細菌感染有關［8］，Jin EH等對972例韓國人（其中哮喘患者424例）進行IL－17F啟動子基因多態性研究，發現rs1889570基因分型與哮喘患者外周血嗜酸粒細胞數相關，其等位基因頻率與健康人群有差異，顯示IL－17F基因多態性與哮喘易感性存在相關性［9］。由此我們推測IL－17F可能是哮喘易感性良好的候選基因。

近10年來，一些學者研究了IL－17FHis161Arg與哮喘的相關性。Ramsey CD等［5］對1027名非裔和歐裔美國女性IL－17F基因分型后，對50個SNPs（包括rs763780在內）進行分析未發現與哮喘易感性有明顯相關性。MD Bazzi等［10］對202例沙特阿拉伯人進行IL－17A及IL－17F基因多態性分析，僅發現IL－17A的一個SNP rs17880588（G／A）與哮喘相關，而IL－17Frs763780與哮喘并無關聯。與之相似，Eun－Heui Jin等人［9］在韓國人群中分析IL－17F多態性，并未發現SNP rs763780與哮喘相關。日本學者［7］分析了867人rs763780（H161R）在內的5個基因多態性，發現IL－17FH161R多態性可能與哮喘的易感性有關，且經校正后發現IL－17F（H161R）突變的純合子CC可能與與哮喘的患病風險負相關。該實驗組人員于體外功能實驗揭示了IL－17F第3外顯子上組氨酸突變為精氨酸，影響IL－17F與受體的結合力，造成其功能的缺失。不同人群中SNP的分布頻率不同，在Ramsey CD的研究中H161R在歐裔美國人的突變率為4.5%，遠低于日本人（11.4%）。哮喘是一種復雜的多基因遺傳傾向的疾病，人體中基因與基因之間有著相互作用及累積效應，環境因素如吸煙（被動或主動）、空氣中粉塵、寵物、職業暴露等等也影響哮喘的易感性。這些均可造成實驗結果的差異。

在我們的實驗中，我們應用DNA測序法對哮喘兒童及健康兒童基因IL－17Frs763780（H161R）進行雙向測序，結果顯示兩組兒童均未發現CC純合子，野生型TT與突變型TC在兩組間存在差異，具有統計學意義。對兩組基因型進行危險度分析顯示，TC可能為哮喘的危險因素［OR 2.09，95%CI（1.12－3.90）］。我們推測IL－17FHis161Arg作為功能位點，單個堿基的突變，引起編碼蛋白質的變化，從而影響IL－17信號傳導及生物學功能。我們對哮喘易感基因研究的最終目的是為了能從基因水平篩選哮喘易感人群，早期診斷，早期干預，并進行更有效的基因治療。相信IL－17FHis161Arg的進一步研究能為哮喘易感性篩查提供新的遺傳學標記，也能為哮喘基因治療及藥物的研發提供新的理論依據。

［1］Eisner MD，Anthonisen N，Coultas D，et，al.An official American Thoracic Society public policy statement：Novel risk factors and the global burden of chronic obstructive pulmonary disease［J］.Am J Respir Crit Care Med，2010，182（5）：693.

［2］http：／／www.who.int／respiratory／asthma／en／

［3］Kawaguchi M，Takahashi D，Hizawa N，et a1.IL－17Fsequence variant（his161arg）is associated with protection against asthma and antagonizes wild－type IL－17Factivity［J］.J Allergy Clin Immunol，2006，117：795.

［4］Eun－Heui Jin，Eun－Young Choi，et al.Significiant association between IL－17Fpromoter region polymorphism and susceptibility to asthma in a Korean population［J］.Int Arch Allergy Immunol，2011，155：106.

［5］Ramsey CD，Lazarus R，Camargo CA，et a1.Polymorphisms in the interleukin 17Fgene（IL－17F）and asthma［J］.Genes and immunity，2005，6：236.

［6］Kawaguchi M，Takahashi D，Hizawa N，et al.IL－17Fsequence variant（His161Arg）is associated with protection against asthma and antagonizes wild－type IL－17Factivity［J］.J Allergy Clin Immuno1，2006，117（4）：795.

［7］Cheung PF，Wong CK，Lam CW.Molecular mechanisms of cytokine and chemokine release from eosinophils activated by IL－17A，IL－17F，and IL－23：implication for Th17lymphocytes－mediated allergic inflammation［J］.J Immunol，2008，180：5625.

［8］Chen J，Deng Y，Zhao J，et al.The polymorphism of IL－17G－152A was associated with childhood asthma and bacterial colonization of the hypopharynx in bronchiolitis［J］.J Clin Immuonl，2010，30：539.

［9］Eun－Heui Jin，Eun－Young Choi，et al.Significiant association between IL－17Fpromoter region polymorphism and susceptibility to asthma in a Korean population［J］.Int Arch Allergy Immunol，2011，155：106.

［10］Bazzi MD，Sultan MA，Al Tassan N，et al.Interleukin 17Aand F and Asthma in Saudi Arabia：Gene Polymorphisms and Protein Levels［J］.J Investig Allergol Clin Immunol，2011，21（7）：551.

Analysis of IL－17F Mutation in Children Asthma

ZHAO Hong－xia，LIU Yu，ZHUANG Ha－na.（Department of Ped－

iatric，Shenzhen Maternity and Children Health Care Hospital Affiliated to Southern Medical University，Shenzhen 518028，Guangdong Province，China）

ObjectiveTo explore the correlation between IL－17Fgene polymorphism and children asthma，providing some theoretical basis for pathophysiology and identification of susceptibility to asthma.Methods60Follow－up children with asthma in clinic were enrolled randomly to be asthma group，sixty healthy children were set as control group.2ml peripheral vein blood was drawn from each child with empty stomach in early morning.Each blood sample was extracted genomic DNA，Polymerase chain reaction（PCR），gene clone and DNA sequencing were used to analyse the IL－17Fpolymorphisms（rs763780）.ResultsThe H161Rhomozygote（CC）is not found in both asthma group and health group.Significant deviations from the genotypes（TC／TT）of rs763780were found in the asthma and health group.（χ2＝5.71 P＝0.017＜0.05）.The OR for asthma was 2.09（95%CI，1.12－3.90）for the H161Rmutant type（TC），the OR for asthma was 0.76（95%CI，0.60－0.95）for the H161Rwild type（TT）.ConclusionSignificant deviations from the genotypes（TC／TT）of IL－17Frs763780were found between the asthma and control groups，the polymorphisms may be associated with asthma.The H161Rhomozygote（CC）is not found in both groups，The H161Rmutant type（TC）may be the risk of asthma.

asthma；IL－17Fgene；mutation；DNA sequencing

R562.2＋5

A

趙宏霞，女，主任醫師，博士學位，碩士生導師，研

2013－07－22）

1007－4287（2014）10－1649－03

深圳市科技計劃項目（200702077）

＊通訊作者

究方向為小兒呼吸系統疾病。