角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子促進(jìn)大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞體外增殖

吳 剛，張曉健，白 光

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院肝膽外科，遼寧錦州121000)

胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞(pancreatic ductal epithelial cells，PDECs)可在適宜的條件下增殖分化為胰島素分泌細(xì)胞，是胰島移植治療糖尿病(diabetes mellitus，DM)的理想種子細(xì)胞。但是，目前還沒(méi)有一套良好的PDECs培養(yǎng)增殖的實(shí)驗(yàn)方案，實(shí)現(xiàn)PDECs體外大量增殖成為亟待解決的問(wèn)題。角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(keratinocyte growth factor，KGF)是一種能特異性促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子［1－5］，對(duì)多種器官具有保護(hù)作用，并且在損傷修復(fù)過(guò)程中大量表達(dá)，可通過(guò)促進(jìn)有絲分裂、激活信號(hào)通路及調(diào)節(jié)酶活性等方面促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖和遷移作用。本實(shí)驗(yàn)以大鼠胰腺組織為材料，建立一種良好有效的PDECs培養(yǎng)增殖方法，并探討不同濃度的KGF在體外對(duì)大鼠PDECs增殖的影響，尋找解決胰島供體短缺的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠20只，6～7周齡，雌雄不限，體質(zhì)量250～300 g，遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供［SYXK(遼)2009-0004］。

1.2 主要試劑

KGF、DTZ、V型膠原酶和 CK19單克隆抗體(Sigma公司);Hank's液、0.25%胰蛋白酶、RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基(1∶1)和FBS(Gibco公司);DMSO、DAB酶底物顯色試劑盒(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司)。

1.3 原代PDECs的分離、純化和培養(yǎng)

所有大鼠術(shù)前禁食12 h，禁水4 h。采用逆行膽管灌注膠原酶法獲得細(xì)胞。采用不連續(xù)密度梯度離心法、差速貼壁法純化細(xì)胞。將部分細(xì)胞懸液移入非黏附培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，加入無(wú)血清的高糖DMEM/F12培養(yǎng)基(50 μg/L霍亂毒素、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素、1 g/L ITS);另將部分細(xì)胞培養(yǎng)于放置有蓋玻片的培養(yǎng)皿中，行細(xì)胞鑒定。

1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物

收集6孔板中的蓋玻片(蓋……