胃癌染色體7q31.1雜合性缺失的精細作圖及其相關基因探討*

唐運蓮,蘇 琦,程愛蘭,王麗江,張 楊,胡果宇,甘潤良

(南華大學腫瘤研究所,湖南衡陽421001)

腫瘤的發生、發展與染色體基因的改變有密切的關系,高頻率雜合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)是人類惡性腫瘤的發生和發展密切相關的抑癌基因(TSG)存在的標志,而LOH是導致TSG失活的重要機制之一[1-2]。近年來,染色體7q LOH越來越受到研究者的關注,發現7q31.1區域LOH在多種人類腫瘤,如卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌等中頻繁出現[3-5],提示該區域可能存在與人類腫瘤發生、發展相關的TSG。本課題選擇覆蓋染色體7q31.1上的7個高密度微衛星位點,并結合PCR技術,檢測胃癌染色體 7q31.1區域的 LOH,進一步研究胃癌的分子遺傳學改變。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 胃癌配對標本 標本來自南華大學附屬第一醫院,收集2002年1月至2003年12月的胃癌及相應配對的正常胃黏膜石蠟包埋標本30例。所有胃癌病例均經病理學檢查確診。胃竇部12例,胃體部14例,胃底或賁門部4例;高分化腺癌5例,低分化腺癌15例,黏液癌6例,印戒細胞癌4例;早期胃癌2例,進展期胃癌28例;有淋巴結轉移11例,無淋巴結轉移19例。胃癌患者中,男 21例,女9例,＜50歲 10例,≥50歲20例,平均年齡51.6歲。

表1 7q31.1區域微衛星位點引物序列

1.1.2 試劑 蛋白酶K購于Merck公司(上海生工代理);Chelex-100購于Bio-Rad Laboratory。

1.1.3 引物 選擇設計在7q31.1區域的微衛星多態性位點引物7對,共覆蓋染色體7q區域的遺傳距離為9.3 cm。引物由大連寶生物工程公司合成(表1)。

1.2 實驗方法

1.2.1 石蠟切片預處理 將石蠟標本做成10 μ m×10的連續切片。為避免交叉污染,切不同病例的蠟塊時,用二甲苯擦洗刀片兩遍。第1張與最后1張行HE染色作為對照片,中間其余切片經常規切片脫蠟后,快速伊紅染色,室溫晾干備用。

1.2.2 顯微切割 參照對照片,用Olympus光學顯微鏡,在10倍物鏡下持自制好的切割工具在癌細胞巢、不典型增生病灶周圍刻化、切挖直至其與周圍組織分離[6]。再將“細針”的尖端蘸一下中性樹膠,使其具有黏性,然后將該“細針”漸漸接近被切割的細胞,小心讓其表面的膠與被切割的細胞接觸,一旦二者接觸即抽回“細針”,針尖端黏取的細胞就隨之與載玻片分離,緊接著將其移入潔凈的1.5 mL EP管中,用于DNA提取。

1.2.3 DNA提取 EP管中,切割下來的細胞經二甲苯脫蠟2次,每次30 min,經無水乙醇然后水化2次,每次30 min。采用Chelex-100法7～8抽提石蠟組織DNA,測定OD值大于1.60符合實驗要求。用 200 μ L的5%Chelex提取液[5%Chelex、0.2%SDS 、10 mM T ris(pH 8.0)、0.5 mM EDTA(pH 8.0)]懸浮沉淀,加入 5μL 20 mg/mL蛋白酶K消化,55℃水浴振搖至溶液變澄清。98℃加熱10 min,離心取上清液,4℃儲存備用。

1.2.4 胃癌染色體7q31.1等位基因LOH檢測和分析

1.2.4.1 微衛星位點PCR擴增 PCR反應體系為25 μ L,10×PCR 反應緩 沖液 2.5 μ L,25 mmol/L MgCl21.5 μ L,10 mmol/L dNTP 0.5μ L,10μ mol/L 上、下游引物各 1 μ L,模板2 μ L,5 μ nit/μLTaq 聚合酶 0.25 μ L,余下由滅菌去離子水補足。反應參數為:94℃預變性5 min,94℃變性1 min,54～60.5℃退火45 s,72℃延伸30 s,40個循環,最后72℃延伸10 min。5%Chelex提取液作空白對照,新鮮胃癌組織提取DNA作陽性對照。

1.2.4.2 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 配制8%的變性聚丙烯酰胺凝膠(40%聚丙烯酰胺母液20 mL,尿素 48 g,5×TBE 20 mL,加水至100 mL),每次取10 mL,再加入10%過硫酸銨 50 μ L,TEMED 5 μ L,立即灌膠,1 h左右自然凝固,固定在垂直電泳槽上,沖洗清除加樣孔中凝膠碎膠,電泳液1×TBE,120 V,預電泳15 min。取PCR產物10μL加2×甲酰胺上樣緩沖液5 μ L,99℃變性 6 min,冰水驟冷,上樣。電泳條件:120 V恒壓,室溫下電泳 2 h。

1.2.4.3 硝酸銀染色 電泳完畢,取下聚丙烯酰胺凝膠用蒸餾水漂洗干凈 →10%乙醇固定5 min→1%硝酸氧化5 min→0.012 mol/L AgNO3染色 30 min→0.28 mol/L Na2CO3(含0.019%甲醛)顯色 →10%冰乙酸終止2 min→清水浸泡,照相。

1.2.4.4 LOH的判斷 正常組織的等位基因PCR擴增產物為雜合子時,可提供信息進行LOH分析,腫瘤或癌前病變組織的一對等位基因PCR擴增產物缺少1條或其中1條的相對密度經凝膠圖像分析系統測定減少50%者認為是LOH。所有陽性和可疑病例重復實驗3次。

1.3 統計學方法 SPSS10.0統計軟件進行分析。用四格表確切概率法判斷等位基因缺失與腫瘤及癌前病變各臨床病理特征的相關性,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 胃癌染色體7q31.1上 7個微衛星位點PCR擴增和LOH結果 用顯微切割的方法從石蠟切片中挑取胃癌細胞行染色體LOH的分析,微衛星位點PCR擴增產物均經1.0%瓊脂糖電泳檢測(圖1)。各位點PCR擴增產物行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸銀染色檢測LOH,腫瘤組織的一對等位基因PCR擴增產物缺少1條或其中1條的相對密度經凝膠圖像分析系統測定減少50%,證明是LOH(彩插Ⅰ圖2)。

2.2 胃癌染色體7q31.1 LOH頻率與分布圖譜 結果顯示,30例胃癌病例中21例至少1個位點存在等位基因的缺失(70.0%)。各位點的等位基因缺失頻率分別為:D7S2459 10.0%(3/30),D7S523 6.7%(2/30),D7S2502 23.3%(7/30),D7S486 43.3%(13/30),D7S480 26.7%(8/30),D7S650 26.7%(8/30),D7S2486 20.0%(6/30),其中缺失頻率最高的微衛星位點是 D7S486。21 例 LOH 中,病例 3、7、8、10、13、17、19、20、22、27、29等 11例表現為連續性片段缺失,其中病例3在檢測的7個位點中有6個位點存在缺失。病例3、8、19、22、29在D7S2502和D7S486兩個相鄰位點同時存在LOH,說明這兩個位點為這些病例的共同缺失區域。病例 3、7、10、13、22、27在D7S486和D7S480兩個相鄰位點同時存在缺失,表明這兩個位點則是這些病例的共同缺失區域。值得注意的是,病例3、22在位點D7S2502、D7S486和 D7S480等 3個相鄰的位點均表現為連續性片段缺失(圖3)。根據這3個位點都具有較高頻率的等位基因缺失,推測胃癌染色體7q31.1區域附近常見最小缺失區域位于D7S2502～D7S480之間,大約3.4 cm遺傳距離(圖4)。

圖1 7q31.1微衛星PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 胃癌染色體7q31.1等位基因缺失圖譜

圖4 染色體7q31.1區域核型圖和各位點LOH頻率

表2 不同年齡、性別胃癌患者7q31.1區域LOH的比較

2.3 胃癌染色體7q31.1 LOH與患者年齡、性別的相關性30例胃癌患者中,兩年齡組7q31.1 LOH陽性率差異無統計學意義(P＞0.05)。雖然男性陽性率較女性高,但差異無統計學意義(P＞0.05),見表2。

2.4 胃癌7q31.1 LOH與部位、分化程度、病理分期及轉移的關系 見表3。

表3 胃癌 7q31.1區域LOH與部位、分化程度、病理分期和轉移的關系

3 討 論

現已證明,絕大多數人類腫瘤都存在非隨機的染色體片段缺失,通過分析染色體某區域的微衛星位點LOH圖譜,確定其常見最小缺失區域,用所獲得的資料作為定位克隆的線索,進而獲得目的基因的策略是一項較為成熟的TSG克隆和分析方法,利用該技術策略已成功地分離到 APC、p53、Rb、DCC等TSG。這些TSG活化與胃癌的發生、發展有關[7-9]。

在本研究中,分析了30例胃癌標本在7q31.1區域的等位基因缺失情況,發現至少有一個位點有LOH者占70.0%,常見最小缺失區域位于D7S2502～D7S480之間,本實驗結果顯示胃癌組織 LOH頻率最高的位點是D7S486(43.3%,13/30)。經分析認為染色體7q31.1區域還存在一個與胃癌密切相關的TSG,定位于位點D7S486,它與位于位點 D7S522的腫瘤抑制基因caveolin-1[10-12]可能不是同一基因。這個結論與Zenklusen[13]的研究結果相符,認為染色體7q31.1區域存在阿非迪霉素誘導的脆性位點Fra7G,定位于該位點的基因就是與多種上皮來源的腫瘤相關的TSG,其最小共同缺失區域大約1.5 Mb大小,并且界定于微衛星位點 D7S486和D7S655之間,所以有理由推測位點D7S486上存在一個與胃癌相關的TSG[13]。這為尋找可能存在的TSG奠定了基礎。

腫瘤的發生、發展是多基因和多步驟異常改變的結果。同一腫瘤的發生、發展可以有不同的遺傳學改變;而同一遺傳學改變亦可以對不同腫瘤的發生、發展起作用,其作用的重要性可以有所不同。在以往的研究中,發現原發性胃癌的發生、發展涉及眾多染色體的增加或缺失。而隨著人類基因組信息的不斷獲得,染色體7q,尤其是7q31.1區域已經成為眾多類型腫瘤,包括頭頸鱗癌、結腸癌、前列腺癌、乳腺癌、腎癌、胰腺癌、胃癌等研究LOH的熱點[14]。

將胃癌染色體7q31.1 LOH結果與患者各臨床病理特征進行統計學分析,表明7q31.1 LOH與患者年齡、性別、腫瘤原發灶部位、腫瘤細胞分化程度、腫瘤臨床分期和淋巴結轉移沒有顯著相關性(P＞0.05),這與李錦添等[15]的報道不一致,可能因為樣本數太少;其中,LOH與4種病理類型均無關,提示存在于位點D7S486上的TSG可能是一作用非常廣譜的胃癌相關TSG,與胃癌各種組織類型的發生均有關聯。

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