Ets-1在不同食管病變組織中的表達及意義

王永霞，王金祥，張哲瑩，焦云娟，趙衛星△

(1.新鄉醫學院病理學教研室，河南 新鄉 453003;2.新鄉醫學院第二臨床學院，河南 新鄉 453003)

Ets-l基因(E26 tansformation-specific 1)是一種原癌基因，它通過轉錄激活一系列在細胞外基質改建和血管生成中起重要作用的基因表達，參與細胞外基質的降解、細胞遷移、腫瘤血管生成等多個浸潤轉移環節。已有研究表明，在乳腺癌、甲狀腺癌、胃癌等多種腫瘤細胞中都有Ets-1的表達，其表達上調與腫瘤的浸潤轉移密切相關，同時還可介導細胞增殖、分化和惡性病變[1-3]。本研究首次聯合應用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和Western blotting方法檢測Ets-1在正常食管黏膜組織、癌旁不典型增生組織及食管鱗癌組織中的表達情況。

1 材料與方法

1.1 材料 62例食管鱗癌、20例癌旁不典型增生及40例正常食管黏膜手術切除標本均為河南省安陽市腫瘤醫院2006年2月26日至3月16日手術切除的新鮮標本。標本離體0.5 h內迅速取材，每例標本均在無壞死區癌灶、癌旁3 cm以內及遠端正常黏膜組織處分別取材，全部標本均經常規病理證實為相應病變。全部樣本取材后立即置于液氮冷凍，后移至-80℃超低溫冰箱貯存，用于RT-PC R及Western blotting檢測。

1.2 方法

1.2.1 半定量RT-PCR (1)主要試劑及引物:RNA提取試劑盒及Trizol為Sigma公司產品，一步法RNA PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。引物由北京奧科生物工程公司合成，Ets-1引物:上游5'-CAA ACT TGC TAC CAT CCC GT-3'，下游 5'-TCT GCA AGG TGT CTG TC T GG-3′;內參β-actin引物 :上游 5′-TCA CCC TGA AGT ACC CCA TC-3'，下游 5′-TAG CAC AGC CTG GAT AGC AA-3′。預期擴增片段大小分別為702、227 bp的熒光條帶。(2)組織總RNA提取:取0.1 g組織，加入1 m L預冷的T rizol提取液，在玻璃勻漿器中充分勻漿，其余步驟嚴格按Trizol-RNA提取試劑盒說明書進行，再用分光光度計檢測RNA含量及純度，所得RNA溶解于50μL DEPC處理水中。(3)RT-PC R檢測Ets-1逆轉錄總體系為25 μL，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，混合后離心30 s。取出混勻的反應體系置入PCR儀中。RT-PCR反應條件:50℃30 min進行 RT反應，94℃2 min滅活 RTase;循環參數為94 ℃30 s，57 ℃90 s，72 ℃30 s，共35個循環;72 ℃延伸 10 min。擴增產物取5μL進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上照相和測定分析。以目的基因條帶與內參條帶的比值作為目的基因的相對含量。

1.2.2 Western blotting檢測 用蛋白裂解液提取食管鱗癌、癌旁不典型增生組織及正常食管黏膜組織中的總蛋白，取100 mg組織加入預冷的蛋白裂解液0.5 m L，裂解組織細胞，提取總蛋白。取50 g蛋白進行100 g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉移到PVDF膜上。轉移后的NC膜置封閉液中，室溫封閉1 h，Ets-1及β-actin抗體稀釋濃度均為1∶500，將膜置于用封閉液稀釋的一抗中，室溫微搖 2 h，將膜置于用含1%(W/V)去脂奶粉的TBS稀釋的二抗中，室溫輕搖2 h。按照ECL發光液試劑盒的說明書配制工作液，將膜放于工作液中作用1 min，然后壓片曝光，觀察結果。Western blotting結果的灰度值分析采用Gene Tools軟件完成。

2 結 果

2.1 RT-PCR法檢測Ets-1 m RNA在不同食管病變組織中的表達 RT-PCR擴增結果經凝膠電泳顯示，Ets-1 m RNA RTPCR擴增產物與預計一致，其片段大小為702 bp，內參β-actin片段大小為227 bp。擴增結果經凝膠灰度掃描而對 Ets-1 m RNA陽性表達進行定量，在正常黏膜、不典型增生及食管鱗癌組織中Ets-1 m RNA的含量依次增高，組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1、圖 1。

圖1 食管鱗癌、不典型增生及正常食管黏膜組織中Ets-1 m RNA的RT-PCR檢測

表1 正常食管黏膜、不典型增生及食管鱗癌組織中Ets-1 m RNA的表達

表2 食管鱗癌組織中Ets-1 m RNA的表達與臨床病理學參數的關系

2.2 RT-PCR法檢測食管鱗癌組織中Ets-1 m RNA的表達與臨床病理學及生物學行為的關系 62例食管鱗癌標本中Ets-1 m RNA的相對表達量與患者的性別、年齡無關(P＞0.05)，與淋巴結的轉移密切相關(P＜0.05)。其次Ets-1 m RNA的相對表達量隨著食管鱗癌分化級別及浸潤深度的升高而升高，但差異無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

2.3 Western blotting法檢測Ets-1蛋白在不同食管病變組織中的表達 利用蛋白裂解液分別提取不同部位食管組織總蛋白，經過SDS-PAGE、轉膜、一抗反應、二抗反應，然后曝光顯影，最后利用Gene Tools軟件進行蛋白相對表達分析。Ets-1蛋白在食管正常黏膜組織及不典型增生組織中的表達量均低于其在食管鱗癌組織中的表達，見表3、圖2。

表3 正常食管黏膜、不典型增生及食管鱗癌組織中Ets-1蛋白的表達

圖2 食管鱗癌、不典型增生及正常食管黏膜組織中Ets-1蛋白Western bloting檢測

3 討 論

腫瘤的發生是一個多步驟、多階段的演進過程，即:單純增生-異常增生-癌前病變-癌變，除原癌基因激活外，常伴隨一個或多個基因功能的失活或丟失[4]。食管癌是中國最常見的惡性腫瘤之一，其發病率高，治療效果欠佳，居癌癥死亡的第6位[5-6]。其中鱗狀細胞癌占食管癌的90%，是食管癌的主要組織學類型[7]。

Ets家族是最大的信號依賴轉錄因子家族之一，可分成Ets、ERG、ELG及EIF等9個亞族。其中Ets亞族由Ets-1與Ets-2組成[8]。人類 Est-1基因位于染色體11q23，編碼分子量為54 k D的Est-1蛋白[9]。Est-1最初鑒定為鳥類白血病逆轉錄病毒E26基因組中原癌基因v-Ets的細胞性前體，是Ets轉錄因子家族的祖先[10-11]。Ets-l基因與從禽類白血病逆轉錄病毒E26中分離的v-Ets-l基因序列具有同源性，是一種原癌基因。它通過轉錄激活一系列在細胞外基質改建和血管生成中起重要作用的基因的表達，參與細胞外基質降解、細胞遷移、腫瘤血管生成等多個浸潤轉移環節。同時，其過度表達和許多人類腫瘤的發生有著密切的聯系，近年已成為各國學者的關注熱點。

本研究采用 RT-PCR及Western blotting兩種實驗方法聯合檢測了食管不同病變組織中Ets-1 m RNA及蛋白的相對含量，結果顯示，正常食管黏膜組織中Ets-1 m RNA相對含量顯著低于癌旁不典型增生組織及癌組織的相對含量。提示Ets-1基因在食管鱗癌的發生過程中可能發揮了重要作用。臨床病理分析發現Ets-1 m RNA的表達與許多臨床因素如患者的年齡、性別等無關，但與食管癌的淋巴結轉移密切相關，提示Ets-1在癌組織中呈高表達，具有更強的侵襲轉移能力。另外，本研究結果還顯示，Ets-1 m RNA的相對表達量隨著食管鱗癌分化級別及浸潤深度的升高而升高，說明Ets-1在食管癌的分化及浸潤過程中也發揮了作用，雖然結果并不具有統計學意義，可能與樣本量較少有關。

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