補陽還五湯延緩細胞衰老改善特發性肺纖維化的機制研究

中圖分類號 R965；R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2025）10-1186-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.10.06

Mechanism of Buyang huanwu tang in improving idiopathic pulmonary fibrosis by delaying cellular senescence

CHEN Long，QU Jinglian（College of Basic Traditional Chinese Medicine，Guizhou University of TraditionalChinese Medicine，Guiyang ，China）

ABSTRACT OBJECTIVE To investigate the improvement effect and mechanism of Buyang huanwu tang on idiopathic pulmonary fibrosis（IPF）model rats. METHODS The rats were randomly divided into normal group，model group，pirfenidone group（positive control， ），Buyang huanwu tang low- ，medium- and high-dose groups （6.435，12.87，25.749/kg） ， with 6 rats in each group. Except for the normal group，IPF model was established in the remaining groups by intratracheal injection of bleomycin sulfate. On the second day after successful modeling，medication was administered once a day for 28 consecutive days. After the last medication，the appearance and morphology，pathological changes，and fibrosis status of the lung tissues in rats were observed. cyclin-dependent kinase inhibitor 2A（P16），P21，transforming growth factor- （TGF- β_l ），Smad3， Smad7，epidermal growth factor （EGF），epidermal growth factor receptor （EGFR），matrix metalloproteinase 12 （MMP-12）， chemokine ligand 2（CCL2）and interleukin-4（IL-4）protein expression in lung tissue were all determined. RESULTS Compared with the normal group，the lung tissue of rats in the model group exhibited gray-white color，harder texture，obvious bruising and cysts. Additionally，alveolar septa were significantly thickened，their structural integrity severely compromised，accompanied by pronounced infiltration of inflammatory cells and severe pulmonary fibrosis. Collagen volume fraction，protein expressions of P16， P21，TGF- ?β_{β} ，Smad3，EGF，EGFR and（IL-4）in lung tissue significantly increased（ Plt;0.05 or Plt;0.01 ），while Smad7，MMP-12 and CCL2 protein expressions were significantly decreased （ Plt;0.05 or Plt;0.01 ）. Compared with the model group， the appearance，pathological morphology，and fibrosis degree of rat lung tissue in Buyang huanwu tang groups were significantly improved，and the above quantitative indicators were significantly reversed （ Plt;0.05 or Plt;0.01 ）. CONCLUSIONS Buyang huanwu tang can ameliorate IPF in rats，and its underlying mechanism may be associated with the inhibition of TGF- β 1/Smad signaling pathway activity and the attenuation of cellular senescence.

KEYWORDS Buyang huanwu tang；idiopathic pulmonary fibrosis；cellular senescence；TGF-β1/Smad signaling pathway

特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一類慢性、進展性間質肺損傷疾病，目前認為其發病機制主要包括肺泡上皮細胞損傷修復異常和肌成纖維細胞過度活化，導致細胞外基質（extracellular matrix，ECM）過度沉積，形成肺纖維化[1]。目前，IPF 患者的數量呈逐年增加趨勢[2]，因該發病隱匿且肺纖維化不可逆，患者的中位生存期僅為 2～3 年[3]。臨床針對IPF的治療手段有肺移植和藥物治療，雖然藥物治療能暫緩IPF 進程，但對肺部炎癥、持續性纖維化等均無顯著作用[4]。

有研究表明，細胞衰老可能是IPF 發生的重要因素[5]。IPF患者肺組織中細胞周期抑制蛋白[如細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑 2A（cyclin-dependent kinase in‐hibitor 2A，CDKN2A；簡稱為 P16）、CDKN1A（簡稱為P21）]表達明顯升高，且與IPF 的病情嚴重程度呈正相關[6]；此外，增多的衰老細胞可通過促進衰老相關分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）等關鍵效應因子的釋放加速IPF 發展[7]。在細胞衰老這一過程中，轉化生長因子 β₁ （transforming growth factor- ?β ，TGF- ）/Smad信號通路扮演了重要角色，抑制該信號通路可延緩細胞衰老，從而緩解 IPF^[8] 。

中醫認為IPF屬“肺痹”“肺痿”疾病范疇。本課題組前期研究發現，IPF發病的關鍵環節乃“肺損絡傷”，以肺氣虧虛為本、痰瘀伏絡為標。因此，臨床常以益氣活血通絡療法為主要治法。補陽還五湯出自清代王清任《醫林改錯》，是益氣活血的代表方劑，具有補而不滯、活血不傷正的特點。近年來，補陽還五湯被廣泛用于IPF 的治療，且取得了較好療效[9]。基于此，本研究通過建立IPF大鼠模型，從細胞衰老的角度，探究補陽還五湯治療IPF的作用機制，以期為臨床治療IPF提供理論基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

EG1150H 型包埋機、RM2265 型切片機購自德國Leica公司；H185OR型臺式高速冷凍離心機購自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；BX35 型正置光學顯微鏡購自日本 Olympus 公司；PowerPac Basic 型電泳儀、165-8004型濕法轉膜儀、ChemiDocTM型化學發光檢測系統均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 主要藥品與試劑

黃芪、赤芍、川芎、當歸、地龍、紅花、桃仁飲片（批號分 別 為 211101、210101、210301、220201、211001、211201、20211208）均購自貴陽市同仁堂大南門店，經貴州中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室吳之坤教授鑒定為真品。硫酸博來霉素（批號B802467，規格 25mg ）、吡非尼酮（批號M823668，純度 98% ）均購自上海麥克林生化科技有限公司；兔源TGF- ?β 、Smad同源物3（Smad3）、Smad7、P16、P21、表皮生長因子（epidermal growth fac‐tor，EGF）、表皮生長因子受體（epidermal growth factorreceptor，EGFR）多克隆抗體（批號分別為 bs-0086R、bs-3484r 、bs-0566R、bs-0740R、bs-55160R、bs-2010R、bs-0165R）均購自北京博奧森生物技術有限公司；鼠源基質金屬蛋白酶 12（matrix metalloproteinase 12，MMP-12）單克隆抗體（批號sc-390863）購自圣克魯斯生物技術（上海）有限公司；兔源趨化因子配體2（chemokine ligand 2，CCL2）、白細胞介素 4（interleukin-4，IL-4）多克隆抗體，兔源GAPDH 單克隆抗體，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（批號分別為 66272-1-Lg、66142-1-Lg、60004-1-Lg、SA00001-2）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色液、Masson 染色試劑盒（批號分別為G1120、G1340）購自北京索萊寶科技有限公司；免疫組化試劑盒（批號為PV-9000）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗動物

本研究所用動物為8 周齡SPF 級SD 大鼠，體重200～220g ，共36只，雌雄各半，均購自長沙市天勤生物技術有限公司，動物生產許可證號為SCXK（湘）2019-0014。大鼠飼養于貴州中醫藥大學動物實驗中心，環境溫度 （22±2）^°C 、相對濕度 （40±5）% ，光照明暗 12h 交替飼養。大鼠適應性喂養1周后進行實驗，本實驗經過貴州中醫藥大學倫理委員會批準（編號為20220117）。

2 方法

2.1 補陽還五湯藥液制備

取黃芪 120g 、當歸 6g 、赤芍 4.5g 、地龍 3g 、川芎 3g 、紅花 3g 、桃仁 3g 混勻，加入10 倍量水浸泡1 h，煮沸后以小火煎煮 90min ，過濾；再加入10倍量水，煮沸后以小火煎煮1 h，過濾；合并2 次濾液，濃縮，即得質量濃度為1.287g/mL 的補陽還五湯藥液（以生藥量計）。

2.2 分組、造模與給藥

將36 只大鼠隨機分為正常組、模型組、吡非尼酮組（陽性對照， 0.162g/kg ，劑量根據臨床等效劑量換算）和補陽還五湯低、中、高劑量組 （6.435，12.87，25.74g/kg ，其中中劑量為臨床等效劑量），每組6只。除正常組外，其余各組大鼠吸入異氟烷麻醉后，參照文獻[10]方法構建IPF模型：將大鼠以 30^° 仰臥位固定，用18號套管針經聲門插入氣管，確認插管成功后，迅速經套管針注射硫酸博來霉素（ 5mg/mL ），然后快速將大鼠直立并沿縱軸旋轉促進藥物在其肺內分散；當大鼠出現喜靜倦動、皮毛微黃枯燥、口唇爪甲紫紺、攝食飲水量減少、弓背姿態等，表明造模成功。造模成功第2天開始給藥，各給藥組大鼠灌胃相應藥液，正常組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續 28d 。

2.3 取材及肺組織外觀形態觀察

末次給藥后，各組大鼠吸入異氟烷麻醉后處死；取大鼠全肺，以生理鹽水沖洗表面，濾紙吸干表面水分，稱重并拍照（以觀察大鼠肺組織結構、出血、瘀斑等病理改變）；然后將左肺置于 4% 多聚甲醛中固定，右肺置于-80^°C 條件下凍存，備檢。

2.4 肺組織病理學形態觀察

將各組大鼠固定的肺組織取出，修剪平整，經梯度乙醇脫水、浸蠟、包埋后，制成厚度為 4μm 的切片；取部分切片分別進行HE染色和Masson染色，然后置于光學顯微鏡下觀察肺組織切片的病理學形態變化，并采用Image J軟件計算膠原沉積分數（膠原沉積分數 視野下膠原纖維面積/總面積 ×100% ）。

2.5 肺組織中P16、P21、TGF- β_β^β（β_β^β） 、Smad3、Smad7、EGF、EGFR蛋白表達檢測

采用免疫組化法進行檢測。取“2.4”項下各組3 只大鼠切片，經脫蠟至水、抗原修復、阻斷后，加入P16、P21、TGF- ?β 、Smad3、Smad7、EGF、EGFR一抗（稀釋度均為1∶100）， 4°C 孵育過夜；次日加入相應二抗（稀釋度均為1∶100），室溫孵育 20min ；以DAB 顯色，經蘇木素復染、分化、返藍、封片后，采用光學顯微鏡觀察，并拍照；采用Image J軟件測定每個視野下各蛋白陽性染色的平均光密度值，以表示相應蛋白的表達水平。

2.6 肺組織中MMP-12、CCL2、IL-4蛋白表達檢測

采用Western blot法進行檢測。取“2.3”項下各組大鼠凍存肺組織 50mg ，充分剪碎后，加入RIPA 裂解液裂解，提取總蛋白。以GAPDH為內參，經上樣、電泳、轉膜和封閉后，加入MMP-12、CCL2、IL-4 一抗（稀釋度均為1∶1 000），孵育過夜；加入相應二抗（稀釋度均為1∶1 000），常溫孵育 。經化學發光試劑顯色后，置于凝膠成像系統中成像，再采用Image J軟件分析灰度值，以目的蛋白與內參蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示目的蛋白的表達水平。

2.7 統計學方法

采用 GraphPad Prism 10.0 軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD- t 檢驗。檢驗水準 α=0.05 。

3 結果

3.1 補陽還五湯對IPF大鼠肺組織外觀形態的影響

正常組大鼠肺組織的結構正常、光滑紅潤、柔軟有彈性；與正常組比較，模型組大鼠肺組織的顏色灰白、質地變硬，有明顯的瘀斑和囊腫；吡非尼酮組和補陽還五湯各劑量組大鼠肺組織的外觀形態均較模型組有所改善，且隨著補陽還五湯劑量的增加，改善效果越明顯，其中補陽還五湯中、高劑量組大鼠肺組織的外觀形態與吡非尼酮組相似。結果見圖1。

圖1 大鼠肺組織外觀形態學觀察

3.2 補陽還五湯對IPF大鼠肺組織病理學形態的影響

HE染色結果顯示，正常組大鼠肺組織正常；模型組大鼠肺組織中肺泡間隔增厚、肺血管基底膜增厚，肺泡結構被嚴重破壞，肺實質結構紊亂，有大量的炎癥細胞浸潤；與模型組比較，吡非尼酮組和補陽還五湯各劑量組大鼠肺組織損傷均明顯減輕，僅有少部分肺泡結構被破壞，肺實質結構規則，炎癥細胞浸潤明顯減少，其中補陽還五湯中、高劑量組大鼠肺組織改善情況與吡非尼酮組相似。結果見圖2。

圖2 大鼠肺組織病理學形態HE染色顯微圖

Masson染色結果顯示，正常組大鼠肺組織有少量纖維化[膠原沉積分數為 （1.118±0.087）%] ；與正常組比較，模型組大鼠肺組織可見大量的膠原纖維增生，纖維化程度明顯，膠原沉積分數[ （1.531±0.093）%] 顯著升高（ （Plt;0.01 ）；與模型組相比，吡非尼酮組和補陽還五湯低、中、高劑量組大鼠纖維化程度減弱，膠原沉積分數[ （1.137±0.091）% 、 （1.309±0.121）% 、 （1.207±0.045）% 、（1.246±0.122）%] 均顯著降低（ _Plt;0.01 ）。結果見圖3。

圖3 大鼠肺組織病理學形態Masson染色顯微圖

3.3 補陽還五湯對 IPF 大鼠肺組織中 P16、P21、TGF-|β₁| 、Smad3、Smad7、EGF、EGFR表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠肺組織中P16、P21、TGF- β₁ 、Smad3、EGF、EGFR 蛋白表達水平均顯著升高（ Plt;0.05 ），Smad7蛋白表達水平顯著降低（ Plt;0.05） ）；與模型組比較，吡非尼酮組和補陽還五湯各劑量組大鼠肺組織中 P16、P21、TGF- β_l 、Smad3、EGF、EGFR 蛋白表達水平均顯著降低（ Plt;0.05） ），Smad7蛋白表達水平顯著升高（ ?Plt;0.05? ）。結果見圖4（鑒于篇幅有限，僅展示P16、P21、TGF- 蛋白表達的免疫組化圖）、。

圖4 各組大鼠肺組織中P16、P21、TGF- ?β 蛋白表達的免疫組化圖

表1

a：與正常組比較， Plt;0.05：6 ：與模型組比較， Plt;0.05

3.4 補陽還五湯對IPF大鼠肺組織中MMP-12、CCL2、IL-4蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠肺組織中 MMP-12、CCL2 蛋白表達水平均顯著降低 （Plt;0.01 ），IL-4 蛋白表達水平顯著升高（ ?Plt;0.01 ）；與模型組比較，吡非尼酮組和補陽還五湯各劑量組大鼠肺組織中MMP-12、CCL2蛋白表達水平均顯著升高（ （Plt;0.01 ），IL-4蛋白表達水平均顯著降低 ?Plt;0.01 ）。結果見圖5、表2。

A：正常組；B：模型組；C：吡非尼酮組；D.補陽還五湯低劑量組；E：補陽還五湯中劑量組；F：補陽還五湯高劑量組。

圖5 各組大鼠肺組織中MMP-12、CCL2、IL-4 蛋白表達的電泳圖

4 討論

IPF 是一種慢性進行性間質性肺病，多見于中老年人群，因其治療手段有限、預后不良，嚴重威脅患者生命健康，因此探尋IPF 的有效治療方法是目前學者們研究的熱點。硫酸博來霉素誘導的IPF模型與人類IPF發生發展的病理進程最為相符，故本研究采用氣道注射硫酸博來霉素的方法復制IPF模型，以研究補陽還五湯對IPF大鼠的改善作用。本研究結果顯示，模型組大鼠肺組織顏色灰白、質地變硬，有明顯的瘀斑；進一步HE 染色和Masson 染色結果顯示，模型組大鼠肺泡結構被嚴重破壞，肺組織存在大量炎癥細胞浸潤，纖維化程度明顯。

表2 各組大鼠肺組織中MMP-12、CCL2、IL-4 蛋白表達水平比較 ）

a：與正常組比較， Plt;0.01 ；b：與模型組比較， Plt;0.01 。

目前，細胞衰老已被認為是IPF 發生的重要機制[5]。本課題組前期研究發現，P16、P21與細胞衰老密切相關，激活P16、P21蛋白表達，可導致細胞周期停滯[11]。因此，抑制P16、P21 蛋白表達是延緩細胞衰老的有效方法。衰老細胞可通過表達SASP，促進炎癥因子、趨化因子、生長因子等的表達，從而加速IPF發展[7]。IL-4是重要的促纖維化因子，研究指出，成纖維細胞中的IL-4 結合相應受體后，可在M2極化巨噬細胞中激活相關通路，進而加速 IPF^[12] 。CCL2 可募集纖維細胞向肺泡損傷部位遷移分化為成纖維細胞并產生過多的ECM 從而促進IPF發展[13]。MMP-12 是ECM 降解的主要效應物，IPF 發生時，ECM出現大量沉積，MMP-12蛋白表達水平降低[14]。本研究結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠肺組織中P21、P16 蛋白表達水平顯著升高，說明IPF 大鼠表現出細胞衰老過程；進一步發現，模型組大鼠肺組織中IL-4蛋白表達水平升高，CCL2、MMP12-蛋白表達水平降低，說明IPF過程分泌大量SASP。

有研究發現，衰老周期抑制蛋白和TGF- ?β₁/Smad 信號通路密切相關，敲除P16 可抑制TGF- β_l 相關通路活性，進而改善肺纖維化模型小鼠的衰老相關肺纖維化[15]。有研究發現，Smad7 是一種負性調控因子，在TGF- β 1/Smad 信號通路中參與逆向改善機制，其表達升高可抑制此通路信號轉導[16]。此外，衰老細胞可分泌EGF使上皮細胞和內皮細胞所處的微環境發生轉變[17]。TGF- ?β_β 屬于EGF 家族中的成員，與EGF 的表達呈正相關，有研究發現，EGF可以促進TGF- 的產生，進而加速組織纖維化[18]。EGFR 是一種多功能的信號轉導子，與細胞衰老密切相關[19]，過量的EGFR可促進TGF- β_l 的表達，加速纖維化[20]。本研究結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠肺組織中TGF- β_l 、Smad3、EGF、EGFR 蛋白表達水平升高，Smad7 蛋白表達水平降低，說明TGF- Smad信號通路被激活。

IPF 的治療以益氣活血為主，補陽還五湯為益氣活血的代表方劑。方中君藥黃芪補氣行血；臣藥當歸活血通絡；佐藥赤芍、川芎、桃仁、紅花化瘀，地龍通絡；諸藥共奏益氣活血、化瘀通絡的功效。本研究結果顯示，經補陽還五湯干預后，IPF 大鼠肺組織外觀和病理學形態均明顯改善，炎癥細胞浸潤減少，肺纖維化程度減弱；肺組織中P16、P21、IL-4蛋白表達下調，CCL-2、MMP-12蛋白表達上調，提示補陽還五湯可抑制IPF 大鼠肺組織細胞衰老。進一步研究發現，補陽還五湯還可下調TGF-β₁ 、Smad3、EGF、EGFR蛋白表達，上調Smad7蛋白表達，提示抑制TGF- _?β 1/Smad信號通路活性，可能是補陽還五湯延緩IPF大鼠細胞衰老的機制之一。

綜上所述，補陽還五湯可改善大鼠IPF，其作用機制可能與抑制TGF- β₁/Smad 信號通路活性、延緩細胞衰老有關。

參考文獻

[ 1 ] MEI Q R，LIU Z，ZUO H，et al. Idiopathic pulmonary fi‐brosis：an update on pathogenesis[J]. Front Pharmacol，2022，12：797292.

[ 2 ] HARARI S，DAVì M，BIFFI A，et al. Epidemiology ofidiopathic pulmonary fibrosis：a population-based study inprimary care[J]. Intern Emerg Med，2020，15（3）：437-445.

[ 3 ] OKUNO D，SAKAMOTO N，AKIYAMA Y，et al. Twodistinct mechanisms underlying γ8 T cell-mediated regula‐tion of collagen type Ⅰ in lung fibroblasts[J]. Cells，2022，11（18）：2816.

[ 4 ] VANCHERI C，KREUTER M，RICHELDI L，et al. Nin-tedanib with add-on pirfenidone in idiopathic pulmonaryfibrosis：results of the INJOURNEY trial[J]. Am J RespirCrit Care Med，2018，197（3）：356-363.

[ 5 ] YAO C F，GUAN X R，CARRARO G，et al. Senescenceof alveolar type 2 cells drives progressive pulmonary fi‐brosis[J]. Am J Respir Crit Care Med，2021，203（6）：707-717.

[ 6 ] áLVAREZ D，CáRDENES N，SELLARéS J，et al. IPFlung fibroblasts have a senescent phenotype[J]. Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol，2017，313（6）：L1164-L1173.

[ 7 ] PHAN T H G，PALIOGIANNIS P，NASRALLAH G K，etal. Emerging cellular and molecular determinants of idio‐pathic pulmonary fibrosis[J]. Cell Mol Life Sci，2021，78（5）：2031-2057.

[ 8 ] YUAN J H，MA Y，YUAN L H，et al. Baicalein attenuatesbleomycin-induced lung fibroblast senescence and lung fi‐brosis through restoration of Sirt3 expression[J]. PharmBiol，2023，61（1）：288-297.

[ 9 ] 趙惠亮，渠景連. 補陽還五湯在特發性肺纖維化中的應用探討[J]. 遼寧中醫雜志，2021，48（10）：53-59.

[10] LIU T J，DE LOS SANTOS F G，PHAN S H. The bleomy‐cin model of pulmonary fibrosis[J]. Methods Mol Biol，2017，1627：27-42.

[11] 李洋，周禹，張振豪，等. 補陽還五湯防治特發性肺纖維化機制研究[J]. 國醫論壇，2023，38（5）：68-72.

[12] XU L P，ZHANG Y，DAI Q D，et al. Scorpion venompolypeptide governs alveolar macrophage M1/M2 polari-zation to alleviate pulmonary fibrosis[J]. Tissue Cell，2022，79：101939.

[13] YANG J B，AGARWAL M，LING S，et al. Diverse injurypathways induce alveolar epithelial cell CCL2/12，whichpromotes lung fibrosis[J]. Am J Respir Cell Mol Biol，2020，62（5）：622-632.

[14] LI G Q，JIN F Q，DU J X，et al. Macrophage-secretedTSLP and MMP9 promote bleomycin-induced pulmonaryfibrosis[J]. Toxicol Appl Pharmacol，2019，366：10-16.

[15] GU X，MENG H Y，PENG C Y，et al. Inflammasome acti‐vation and metabolic remodelling in p16-positive agingcells aggravates high-fat diet-induced lung fibrosis by in‐hibiting NEDD4L-mediated K48-polyubiquitin-dependentdegradation of SGK1[J]. Clin Transl Med，2023，13（6）：e1308.

[16] AN M J，ZHENG H H，HUANG J，et al. Aberrant nuclearexport of circNCOR1 underlies SMAD7-mediated lymphnode metastasis of bladder cancer[J]. Cancer Res，2022，82（12）：2239-2253.

[17] 董丹，張立，鄒洪斌. 衰老與EMT 關系及限食和二甲雙胍對二者作用[J]. 中國公共衛生，2011，27（11）：1439-1441.

[18] 魯佳偉. 表皮生長因子調控肺腺癌IRF-1表達的生物學作用和機制研究[D]. 武漢：華中科技大學，2021.

[19] COCHARD L M，LEVROS L C Jr，JOPPé S E，et al. Ma‐nipulation of EGFR-induced signaling for the recruitmentof quiescent neural stem cells in the adult mouse forebrain[J]. Front Neurosci，2021，15：621076.

[20] 張康，趙婷婷，張波，等. 基于網絡藥理學探究布地奈德治療IgA 腎病的作用機制[J]. 中國全科醫學，2023，26（35）：4453-4458，4463.（收稿日期：2024-12-09 修回日期：2025-04-16）