cpsG基因影響神經膠質瘤細胞轉錄組學分析

摘要：目的" 探討cpsG基因對神經膠質瘤細胞U87MG轉錄組學影響。方法" 將慢病毒rLV-cpsG感染人膠質瘤細胞U87MG，篩選穩定細胞系。提取細胞總RNA，進行高通量RNA測序分析。包括差異基因分析、GO分析、KEGG分析、Reactome分析、DO分析、差異基因的可變剪切分析等。結果" 通過高通量RNA測序技術發現cpsG影響了U87MG細胞的基因轉錄能力，其中上調的基因有TMEM132A、CRAMP1、PRSS3、MAP4K3、SEMA3B等；下調的基因有HOXA11、NFYA、ICA1、SLC7A2、SOX8等。KEGG分析發現上調的KEGG通路主要包括：PI3K-Akt信號通路、Toll樣受體信號通路、TNF信號通路、NF-kappa B信號通路；下調的KEGG通路主要包括：Wnt信號通路、MAPK信號通路、cAMP信號通路、Hippo信號通路。Reactome分析發現上調的Reactome通路主要包括：細胞外基質組織、蛋白質代謝、止血、免疫系統；下調的Reactome通路主要包括：神經系統、生物發育、信號轉導、肌肉收縮。DO分析發現上調的DO通路主要包括：鱗狀細胞癌、胸部癌癥、生殖器官癌、腺癌、胃癌；下調的DO通路主要包括：中樞神經系統癌癥、精神病性障礙、認知障礙、卵巢透明細胞腺癌。可變剪切分析發現：SE占65.97%，MXE占8.07%，A5SS占8.68%，RI占6.82%，A3SS占10.46%。結論" cpsG基因調控了神經膠質瘤細胞的轉錄組學，為人神經膠質瘤的臨床診斷和治療提供了理論依據。

關鍵詞：cpsG；神經膠質瘤細胞；轉錄組學；RNA測序

中圖分類號：R392" " " " " " " " " " " " " nbsp; " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2025.04.001

文章編號：1006-1959（2025）04-0001-09

Transcriptome Analysis of cpsG Gene Affecting Glioma Cells

ZHANG Chen， ZHAN Weiyi， GUO Qiulin， YU Yue， LI Yanna

（School of Medicine， Tongji University， Shanghai 200092， China）

Abstract： Objective" To investigate the effect of cpsG gene on the transcriptome of glioma cell line U87MG. Methods" Lentivirus rLV-cpsG was infected with human glioma cell U87MG， and the stable cell line was screened. Total RNA was extracted and analyzed by high-throughput RNA sequencing. It included differential gene analysis， GO analysis， KEGG analysis， Reactome analysis， DO analysis， variable shear analysis of differential genes， etc. Results" High-throughput RNA sequencing technology showed that cpsG affected gene transcription ability of U87MG cells， and upregulated genes included TMEM132A， CRAMP1， PRSS3， MAP4K3， SEMA3B， etc; down-regulated genes included HOXA11， NFYA， ICA1， SLC7A2， SOX8 and so on. KEGG analysis showed that upregulated KEGG pathways mainly included PI3K-Akt signaling pathway， Toll-like receptor signaling pathway， TNF signaling pathway， NF-kappa B signaling pathway， etc; the down-regulated KEGG pathways mainly included Wnt signaling pathway， MAPK signaling pathway， cAMP signaling pathway， Hippo signaling pathway， etc. Reactome analysis showed that the up-regulated Reactome pathways mainly included extracellular matrix organization， protein metabolism， hemostasis， immune system， etc; the down-regulated Reactome pathways mainly included nervous system， biological development， signal transduction， muscle contraction， etc. DO analysis showed that the up-regulated DO pathway mainly included squamous cell carcinoma， chest cancer， genital organ cancer， adenocarcinoma， gastric cancer， etc; the down-regulated DO pathway mainly includes central nervous system cancer， psychiatric disorders， cognitive disorders， and ovarian clear cell adenocarcinoma. Variable shear analysis showed that SE accounted for 65.97%， MXE accounted for 8.07%， A5SS accounted for 8.68%， RI accounted for 6.82%， and A3SS accounted for 10.46%. Conclusion" cpsG gene regulates the transcriptomics of glioma cells， which provides a theoretical basis for the clinical diagnosis and treatment of human glioma.

Key words： cpsG; Glioma cells; Transcriptomics; RNA sequencing

膠質瘤是全球最普遍的原發性惡性腦腫瘤，膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme， GBM）是最常見的侵襲性類型。盡管二十年多來研究者一直在探索GBM的新治療方法，但在改善患者生存結果方面進展有限[1]。大多數成人彌漫性膠質瘤在進行標準治療后療效較差，尤其是膠質母細胞瘤。隨著對腦免疫微環境的深入了解，免疫療法作為一種新的治療方法備受關注[2]。B組鏈球菌（Group B streptococcus， GBS）是嚴重新生兒感染的主要原因，是一種人體內的機會致病菌，并且是腸道和陰道正常菌群的一部分。母體定植是GBS傳播的主要途徑。在某些情況下，GBS作為一種病原體，從無癥狀的黏膜運輸狀態轉變為一種主要的細菌病原體，導致嚴重的侵襲性感染[3]。B族鏈球菌莢膜多糖（capsular polysaccharide， CPS）是一種重要的毒力因子，也用于GBS分型。所有合成CPS所需的基因均在GBS CPS操縱子上，其中包含一個高度可變的CPS決定區域（cpsG-cpsK）[4]。研究發現[5]，B組鏈球菌cpsG基因改變人類宮頸癌細胞的轉錄組學而抑制其生長增殖。本研究通過構建過表達cpsG的穩定U87MG細胞系，通過體外生長以及高通量RNA測序，探索cpsG可能影響神經膠質瘤細胞的某些轉錄組功能。

1材料與方法

1.1材料" 實驗用細胞：神經膠質瘤細胞U87MG（購自中科院上海細胞所）。實驗試劑：細胞培養用胎牛血清（FBS，500 ml，Gibco）、DMEM液體培養基（500 ml，Gibco）、PBS（500 ml，Gibco）、胰酶（100 ml，上海欲立生物科技有限公司）；rLV-cpsG-HA-ZsGreen慢病毒和rLV-ZsGreen對照慢病毒購自武漢維諾賽生物技術有限公司；嘌呤霉素（10 mg/ml，上海碧云天生物技術有限公司）；RNA測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.2方法

1.2.1人神經膠質瘤細胞U87MG培養" 將人神經膠質瘤U87MG細胞培養于含10%FBS的DMEM完全培養基中，且在飽和濕度以及含5% CO2和37 ℃的細胞培養箱中進行培養。每隔3 d進行1次換液，待細胞長滿后進行傳代培養。

1.2.2慢病毒感染和穩定細胞系構建" 胰酶消化處于對數生長期的U87MG細胞，按照要求進行慢病毒感染，設置對照組和實驗組細胞，48 h后更換培養液。熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效率，將陽性克隆進行傳代培養。1周后采用嘌呤霉素（3 mg/L）進行持續篩選，并在熒光顯微鏡下挑取表達GFP的單克隆細胞于新的培養孔中培養，待長滿后傳代，并擴大培養。

1.2.3 RNA測序" 待對照組和實驗組細胞長滿后，用TRIzol法分別提取對照組和實驗組細胞總RNA，標記為rLV組和rLV-cpsG組，-20 ℃保存，由上海美吉生物醫藥科技有限公司進行醫學有參轉錄組測序，完成2個樣品的轉錄組分析，共獲得13.83 Gb Clean Data，各樣品Clean Data均達到6.86 Gb以上，Q30堿基百分比在94.5%以上。并進行生物信息學分析。基于Illumina平臺，對樣本進行的所有mRNA進行測序，測序實驗采用Illumina NovaSeq Reagent Kit 方法進行文庫構建。使用軟件RSEM分別對基因和轉錄本的表達水平進行定量分析，以便后續分析不同樣本間基因的差異表達情況。利用GO數據庫，可以將基因按照它們參與的生物學過程、構成細胞的組分和實現的分子功能進行分類。對差異表達基因進行GO注釋。利用KEGG數據庫，可將基因按照參與的pathway通路或行使的功能分類。對差異基因進行KEGG注釋。GO富集分析使用軟件Goatools，使用方法為Fisher精準檢驗。KEGG通路富集分析和Reactome富集分析使用Python scipy 軟件包，計算原理同GO功能富集分析。

2結果

2.1過表達cpsG基因的穩定細胞系U87MG的篩選" 慢病毒rLV-cpsG-HA-ZsGreen感染神經膠質瘤細胞U87MG，由于慢病毒載體中有GFP（綠色熒光蛋白）標簽，在熒光顯微鏡下可見轉染成功的細胞顯示為綠色熒光（圖1）。

2.2神經膠質瘤細胞U87MG的基因轉錄能力分析" 韋恩圖分析顯示：1363個基因僅出現在rLV組，1020個基因僅出現在rLV-cpsG組，11 485個基因在兩組中都出現（圖2A）。表達量差異統計分析顯示：與rLV組相比，rLV-cpsG組有1440個上調基因、1593個下調基因（圖2B）。表達量分布圖顯示兩組中的基因分布密度是有差異的（圖2C和圖2D）。火山圖分析（圖3A）和聚類熱圖分析（圖3B）顯示兩組的差異基因，其中重要的上調基因主要包括TMEM132A、ETV1、CCL26、ARSD、PRSS21、CRAMP1、PRSS3、MAP4K3等（表1）；重要的下調基因主要包括HOXA11、NFYA、ICA1、SLC7A2、SOX8等（表2）；上述結果提示cpsG影響了神經膠質瘤細胞U87MG中一些基因的轉錄能力。

2.3神經膠質瘤細胞U87MG的基因功能及信號通路分析

2.3.1 GO分析" 對差異基因進行了GO分析，結果顯示：與rLV對照組相比，rLV-cpsG組中重要的上調的GO主要包括：細胞殺傷（cell killing）、免疫系統過程（immune system process）、生物調節（biological regulation）、代謝過程（metabolic process）、細胞聚集（cell aggregation）等（圖4A和圖4C）。重要的下調的GO主要包括：蛋白折疊伴侶（protein folding chaperone）、BMP信號通路正性調節（positive regulation of BMP signaling pathway）、生物調節（biological regulation）等（圖4B和圖4D）。

2.3.2 KEGG分析" 對差異基因進行了KEGG富集分析，結果顯示：與rLV對照組相比，rLV-cpsG組中有顯著意義的上調的KEGG通路主要包括：PI3K-Akt信號通路、Toll樣受體信號通路、TNF信號通路、NF-kappa B信號通路等（圖5A和圖5C）；有顯著意義的重要的下調的KEGG通路主要包括：Wnt信號通路、MAPK信號通路、cAMP信號通路、Hippo信號通路等（圖5B和圖5D）。

2.3.3 Reactome分析" 對差異基因進行了Reactome分析，結果顯示：與rLV對照組相比，rLV-cpsG組中有顯著意義上調的Reactome通路主要包括：細胞外基質組織（extracellular matrix organization）、蛋白質代謝（metabolism of proteins）、止血（hemostasis）、免疫系統（immune system）等（圖6A、圖6C）。有顯著意義的重要的下調的Reactome通路主要包括：神經系統（neuronal system）、生物發育（developmental biology）、信號轉導（signal transduction）、肌肉收縮（muscle contraction）等（圖6B、圖6D）。

2.3.4 DO分析顯示" 對差異基因進行了DO分析，與rLV對照組相比，rLV-cpsG組中有顯著意義的上調的DO通路主要包括：鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma）、胸部癌癥（thoracic cancer）、生殖器官癌（reproductive organ cancer）、腺癌（adenocarcinoma）、胃癌（stomach cancer）等（圖7A和圖7C）。有顯著意義的重要的下調的DO通路主要包括：中樞神經系統癌癥（central nervous system cancer）、精神分裂（schizophrenia）、卵巢透明細胞腺癌（ovarian clear cell adenocarcinoma）等（圖7B和圖7D）。

2.4神經膠質瘤細胞基因的可變剪切能力分析" 對差異基因進行了可變剪切分析，包括可變3′端剪切位點（A3SS）、可變5′端剪切位點（A5SS）、內含子保留（RI）、外顯子跳躍（SE）、外顯子互斥（MXE）。結果顯示：SE占65.97%，MXE占8.07%，A5SS占8.68%，RI占6.82%，A3SS占10.46%（圖8、表3、表4）。結果提示cpsG影響了神經膠質瘤細胞中一些基因的可變剪切能力。

3討論

3.1 cpsG改變了神經膠質瘤細胞中基因的轉錄能力" 本研究通過高通量RNA測序技術發現cpsG能夠調控U87MG細胞部分基因的轉錄能力。研究表明，上述cpsG上調的基因中TMEM132A、HECW1、HSPB6、MEOX1與腫瘤的發生有關。新型跨膜蛋白（TMEM）132家族與人類多種神經系統疾病和癌癥有關[5]。TMEM132A在胃癌組織中表達上調[6]，提示在一些腫瘤中TMEM132A可能促進腫瘤細胞的增值。cpsG能夠促進TMEM132A的轉錄能力，提示TMEM132A可能在cpsG的作用下在神經膠質瘤細胞中發揮相反的作用。大多數透明細胞腎細胞癌的HECW1表達降低[7]。HECW1在非小細胞肺癌細胞系的表達顯著增加[8]。cpsG上調了HECW1的表達，提示cpsG可能通過增強HECW1的表達而發揮抑癌作用。研究表明HSPB6在結腸癌組織和骨肉瘤中的表達下調[9，10]，HSPB6可能是一個抑癌基因。cpsG能夠促進HSPB6的轉錄能力，HSPB6在cpsG的作用下抑制U87MG細胞生長。研究發現MEOX1 mRNA在肺癌組織中較正常鄰近組織低表達，且MEOX1 mRNA表達與肺癌患者尤其是肺腺癌患者的生存率呈正相關[11]，提示MEOX1可能是一個抑癌基因。cpsG增強了MEOX1的表達，提示cpsG可能通過促進MEOX1的轉錄而抑制U87MG細胞增值。上述推測均有待實驗進一步證實。

本研究中發現在U87MG細胞中能被cpsG下調的基因HOXA11、SOX8、KDM7A、NOS2與腫瘤的發生有關。研究表明HOXA11被過度強調為惡性腫瘤增殖和轉移過程中必不可少的啟動物和促進物[12]，提示HOXA11是一個促癌基因。cpsG抑制了HOXA11的轉錄，推測cpsG通過抑制HOXA11的表達從而發揮抑癌作用。SOX8在不同類型的癌癥中表達上調[13]，提示SOX8是一個促癌基因。cpsG抑制SOX8的轉錄，推測cpsG可能通過抑制SOX8的表達從而發揮抑癌作用。胰腺腫瘤表達高水平的一氧化氮合酶（NOS）[14]，提示NOS在一些癌癥中是一個促癌基因。cpsG下調了NOS2的轉錄，推測cpsG可能通過抑制NOS2的表達而發揮抑癌作用。以上推測均有待實驗進一步驗證。

3.2 cpsG調節了U87MG細胞中的一些基因的功能和信號通路" 本研究中通過GO分析、KEGG分析、Reactome分析和DO分析發現cpsG調節了U87MG細胞中的一些基因的功能和信號通路，被cpsG上調的GO主要包括：細胞殺傷、免疫系統過程、生物調節、代謝過程、細胞聚集等。被cpsG下調的GO，主要包括蛋白折疊伴侶、BMP信號通路正性調節、生物調節等。被cpsG上調的KEGG通路，主要包括：PI3K-Akt信號通路、Toll樣受體信號通路、TNF 信號通路、NF-kappa B信號通路等；被cpsG下調的KEGG通路主要包括：Wnt信號通路、MAPK信號通路、cAMP信號通路、Hippo信號通路等。被cpsG上調的Reactome通路，主要包括：細胞外基質組織、蛋白質代謝、止血、免疫系統等。被cpsG下調的Reactome通路主要包括：神經系統、生物發育、信號轉導、肌肉收縮等。被cpsG上調的DO通路，主要包括：鱗狀細胞癌、胸部癌癥、生殖器官癌、腺癌、胃癌等。被cpsG下調的DO通路，主要包括：中樞神經系統癌癥、精神病性障礙、認知障礙、卵巢透明細胞腺癌等。

研究發現BMP靶向可以消除保護性骨髓微環境中的白血病細胞，從而有效地影響髓性白血病中白血病干細胞的殘留抗性或持久性[15]。cpsG下調了BMP信號通路，提示cpsG可能參與U87MG細胞的BMP信號通路調節，有待實驗進一步驗證。研究發現Toll樣受體是炎癥和腫瘤發生相關的關鍵傳感器。Toll受體信號通路與多種組織的致癌事件有關[16]。cpsG增強了Toll樣受體信號通路活性，推測cpsG可能通過參與U87MG細胞的腫瘤發生過程，有待實驗進一步驗證。Wnt信號通路是一個高度保守的調控細胞增殖、分化、凋亡、干細胞自我更新、組織穩態和傷口愈合的信號通路。Wnt通路的失調復雜地參與了各種癌癥發生的幾乎所有階段[17]。cpsG能夠顯著抑制Wnt信號通路活性，提示cpsG可能通過阻礙該信號通路而起到抑制U87MG細胞增值。研究表明絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在包括肝癌在內的幾種惡性腫瘤的發展中起著重要作用[18]。cpsG能夠抑制MAPK信號通路活性，推測cpsG可能通過抑制該通路活性起到抑癌作用。卵巢癌的生長和代謝在很大程度上依賴于cAMP-PKA-CREB軸信號處理的改變，通常與腫瘤轉化、轉移、增殖和細胞凋亡抑制有關[19]。cpsG抑制了cAMP信號通路活性，提示cpsG可能通過影響該通路的活性起到抑癌作用。Hippo信號通路是一個高度保守的通路，最近被證明與肺癌、乳腺癌或結直腸癌等多種癌癥的腫瘤發生和轉移有關，但在腦腫瘤中的研究仍很少[20]。Hippo通路的失調會導致多種疾病，包括癌癥、眼部疾病、心臟病、肺部疾病、腎臟疾病、肝臟疾病和免疫功能障礙[21]。cpsG抑制了Hippo信號通路活性，推測cpsG可能通過抑制該通路活性參與神經膠質瘤的發生發展。以上推測均有待實驗進一步驗證。

總之，cpsG影響了U87MG細胞轉錄組學，主要通過上調TMEM132A、HECW1、HSPB6、MEOX1和下調HOXA11、SOX8、KDM7A、NOS2基因的轉錄，從而抑制了Wnt信號通路、MAPK信號通路、cAMP信號通路、Hippo信號通路和激活了PI3K-Akt信號通路、Toll-樣受體信號通路、TNF信號通路、NF-kappa B信號通路等，可為神經膠質瘤的臨床診斷和治療提供參考。

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收稿日期：2024-02-20；修回日期：2024-02-28

編輯/肖婷婷