共聚物納米顆粒遞送LNA反基因鎖核酸對轉基因小鼠HBV的抑制研究

【摘要】目的探索納米載體介導的LNA反基因鎖核酸（LNA antigene）在乙型肝炎病毒（HBV）轉基因小鼠模型中對HBV的抑制效果。方法將LNA antigene與聚乳酸-羥基乙酸共聚物結合，制備LNA antigene納米顆粒（NP），并通過納米顆粒跟蹤分析（NTA）和Zeta電位測定其粒徑和表面電位。評估其包封率、載藥量及在HepG2肝癌細胞中的攝取效率。隨后，分析LNA antigene-NP的體外釋放特性及其對轉基因小鼠HBV DNA、HBsAg和HBeAg表達的抑制效果。結果成功制備LNA antigene-NP納米顆粒，其粒徑集中在125～225 nm之間，表面電位較未修飾的NP有所降低。LNA antigene-NP的包封率為32%，載藥量為8.448 mg。在HepG2肝癌細胞中，LNA antigene-NP顯示出顯著的細胞攝取效率。體外釋放實驗顯示，LNA antigene-NP在24天內表現出持續釋放的特點，最終釋放率接近90%。在轉基因小鼠中，LNA antigene-NP對HBV DNA、HBsAg和HBeAg的抑制效果呈劑量依賴性，5 kg/mg劑量組在第7天的抑制率分別達到約40%、60%和60%。結論LNA antigene-NP納米顆粒能夠有效抑制HBV的復制和抗原表達，為進一步開發基于LNA的抗HBV治療提供了實驗基礎。

【關鍵詞】共聚物納米顆粒；LNA反基因鎖核酸；乙型肝炎病毒；轉基因小鼠；抗病毒治療

中圖分類號：R512.6+2文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2025.01.002

Study on the inhibition of HBV in transgenic mice by the delivery of

LNA antigene through copolymer nanoparticles

WEI Wujun DENG Yibin LUO Yanhong XIAO Shurong XU Guidan

HU Rentong1abc， PENG Bin4， NONG Shunqiang5， CHEN Xiaohao1abc

（1a. Center for Medical Laboratory， 1b. Key Laboratory of Research on Clinical Molecular Diagnosis for Western Guangxi

High Incidence Diseases of Guangxi Universities， 1c. Baise Key Laboratory for Research and Development on Clinical

Molecular Diagnosis for High Incidence Diseases， 1. Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，

Baise 533000， Guangxi， China; 2. Teaching and Research Office of Clinical Biochemistry and Molecular Biology Laboratory，

Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China; 3. Department of Clinical Laboratory， the

First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530000， Guangxi， China; 4. Department

of Clinical Laboratory， Affiliated Hospital of Guilin Medical University， Guilin 541000， Guangxi， China;

5. Department of Clinical Laboratory， Baise People's Hospital， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】ObjectiveTo investigate the inhibitory effects of nanoparticle-mediated locked nucleic acid antigene （LNA antigene） on hepatitis B virus （HBV） in transgenic mouse model. MethodsLNA antigene was conjugated with polylactic acid-glycolic acid （PLGA） to prepare LNA antigene nanoparticles （NPs）， and particle size and surface charge were determined by nanoparticle tracking analysis （NTA） and Zeta potential measurement. Encapsulation efficiency， drug loading capacity， and uptake efficiency in HepG2 hepatocellular carcinoma cells were evaluated. Subsequently， the in vitro release characteristics of LNA anti gene NP and its inhibitory effects on the expressions of HBV DNA， HBsAg， and HBeAg in transgenic mice were analyzed. ResultsLNA antigene-NP was successfully prepared with a particle size ranging from 125 nm to 225 nm， and a lower surface charge compared to unmodified NPs. The encapsulation efficiency of LNA antigene-NP was 32%， and drug loading capacity was 8.448 mg. LNA antigene-NP exhibited significant cellular uptake efficiency in HepG2 hepatocellular carcinoma cells. The in vitro release studies demonstrated a sustained release over 24 days， with a final release rate approaching 90%. In the transgenic mouse model， LNA antigene-NP exhibited dose-dependent inhibition of HBV DNA， HBsAg， and HBeAg， with 5 kg/mg dose group achieving inhibition rates of about 40%， 60%， and 60% on day 7， respectively. ConclusionLNA antigene-NP can effectively inhibit HBV replication and antigen expression， which provides an experimental basis for further development of LNA-based anti-HBV therapies.

【Keywords】copolymer nanoparticles; locked nucleic acid antigene （LNA antigene）; hepatitis B virus （HBV）; transgenic mice; antiviral therapy

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）是一種對全球健康構成重大威脅的病毒，每年有近100萬人因HBV相關疾病死亡［1］。盡管已有強效疫苗，但HBV的傳播和防治仍然面臨巨大挑戰［2］。HBV基因組為一個3.2 kb的部分雙鏈環狀DNA，包含四個開放閱讀框（分別為S、C、P和X），其中的C基因與病毒復制和免疫逃逸密切相關［3］。HBV的生物學復雜性體現在其共價閉合環狀DNA（cccDNA）在肝細胞核內的持久存在，導致現有抗病毒藥物難以清除病毒［4-5］。鎖核酸（locked nucleic acid， LNA）是一種新型核酸類似物，因其在反義寡核苷酸和小干擾RNA中的應用，廣泛用于癌癥和病毒感染的治療［6］。LNA反基因鎖核酸（locked nucleic acid antigene， LNA antigene）能夠特異性地靶向基因組DNA，抑制基因轉錄和病毒復制，近年來其在HBV的研究中引起了廣泛關注［8］。先前的研究顯示，靶向HBV S基因的LNA antigene能夠有效抑制HBV轉基因小鼠中HBV DNA的復制及抗原表達［8］，這為進一步探索針對其他關鍵基因（如C基因）的治療提供了依據。然而，LNA的靶標選擇、遞送效率及長期安全性仍面臨諸多挑戰，這需要通過進一步研究加以優化［9-10］，以確保其在臨床應用中的有效性和安全性。

近年來，納米材料憑借其獨特的物理化學性質，如高表面體積比、可調表面電荷和化學基團，成為新型抗病毒療法的重要研究方向［11］?？共《炯{米材料能夠直接干擾病毒的生命周期，分解病毒核酸或抗生素耐藥基因，從而抑制病毒傳播［12］。其中，基于聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）的共聚物納米顆粒（nanoparticle， NP）在抗病毒治療中得到了廣泛應用［13］。研究表明，PLGA納米顆粒在乙型肝炎疫苗遞送中能夠通過緩慢釋放抗原，顯著增強體液和細胞免疫反應［14］。此外，PLGA納米顆粒還能夠減少傳統疫苗的副作用，并為非侵入性遞送方式提供了可能［15］。基于HBV感染的現有治療手段存在局限性，本研究結合PLGA納米顆粒技術，制備靶向HBV C基因的LNA antigene納米顆粒，旨在評估其在轉基因小鼠模型中對HBV的抑制效果，為未來的臨床應用提供科學依據。

1材料與方法1.1材料HepG2肝癌細胞購自中國典型培養物保存委員會（GNHu39）。HBV轉基因小鼠模型（C57BL/6）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［許可證號：SCXK（京）2016-0011］。LNA antigene由上海生工生物工程股份有限公司合成。無菌雙蒸水（ddH2O）購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司（DG104730）。10%葡萄糖溶液購自石家莊四藥有限公司（50-99-7）。PLGA（分子量：30 000 Da，乳酸：羥基乙酸比例=50∶50，P2191）購自Sigma-Aldrich。胎牛血清（FBS）（10270-106）、青霉素-鏈霉素（15140-122）和高糖DMEM培養基（11965-092）購自Gibco。5-熒光素基醋酸酯（FAM）購自Sigma-Aldrich（F1321）。多聚甲醛溶液（P1110）和DAPI染料（C0065）購自Beijing Solarbio Science amp; Technology Co.， Ltd.。吐溫80購自Sigma-Aldrich（P4780）。恩替卡韋（ETV）購自Sigma-Aldrich（SML1229）。4% EDTA溶液購自Sigma-Aldrich（E5134）。HBV DNA定量檢測試劑盒購自湖南圣湘生物科技股份有限公司（SP2910）。HBsAg（AU3-2100）和HBeAg定量檢測試劑盒（AU3-2400）購自鄭州安圖生物工程股份有限公司。熒光顯微鏡使用Nikon Eclipse Ti型號。納米粒度和Zeta電位分析儀使用Malvern Zetasizer Nano ZS型號。紫外-可見分光光度計使用Thermo Scientific NanoDrop 2000型號。

1.2方法

1.2.1LNA antigene的合成LNA antigene的合成基于HBV的C基因序列。從小鼠血清中提取HBV病毒DNA，使用離心柱法進行提取。通過從NCBI基因數據庫中獲取完整的HBV基因序列（U95551.1；GI：2182117），使用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0等軟件設計、篩選并評估靶向HBV C基因保守核苷酸序列的引物。對設計的引物進行BLAST同源性分析，并將HBV C基因的特異性序列送至上海生工生物工程股份有限公司合成。HBV C基因的上游引物序列：5'-GACCGACCTTGAGGCATACT-3'，下游引物序列：5'-TCCCCACCTTATGAGTCCAA-3'。

1.2.2LNA antigene-NP的制備將儲存在-20 ℃的LNA antigene（0.33 μg/OD）取出，室溫放置15 min后，以356 xg的轉速離心1 min，然后加入100 μL ddH2O并混勻，制備成濃度為0.33 μg/μL的LNA溶液。取1.5 mL無菌EP管，依次加入100 μL的10%葡萄糖和LNA antigene溶液，并用ddH2O將總體積補足至200 μL，渦旋混合后，以356 xg的轉速離心30 s，得到5%葡萄糖-LNA antigene混合液，標記為溶液Ⅰ。另取一個1.5 mL無菌EP管，依次加入100 μL的10%葡萄糖和PLGA，PLGA的用量計算為0.16 μL/μg LNA antigene。然后用ddH2O將總體積補足至200 μL，渦旋混合后，以356 xg的轉速離心30 s，得到5%葡萄糖-PLGA混合液，標記為溶液Ⅱ。將溶液Ⅰ和溶液Ⅱ混合，渦旋混勻后得到400 μL的5%葡萄糖-PLGA-LNA antigene混合物。然后以356 xg的轉速離心30 s，立即在4 ℃下使用該混合物進行轉染，以將PLGA包裹的LNA antigene引入HBV轉基因小鼠體內。

1.2.3粒徑和Zeta電位測定LNA antigene-NP的粒徑和Zeta電位通過納米粒度和Zeta電位分析儀測定。將適量的納米顆粒懸浮于去離子水中，調節濃度至1 mg/mL后，在25 ℃下進行測量。每個樣品均測量三次，并記錄平均值和標準偏差。

1.2.4包封率與載藥量的測定采用間接法，使用核酸/蛋白分析儀測定載體對LNA antigene的包封率和載藥量。計算公式如下：包封率=（實際包封的藥物量/總投入藥物量）×100%；載入率=（納米粒子總質量/實際包封的藥物量）×100%。每個樣品均測定三次，取平均值。將離心收集后的納米顆粒凍干，稱取干粉重量。

1.2.5HepG2肝癌細胞培養與處理將HepG2肝癌細胞在含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養基中培養，37 ℃，5% CO2條件下維持培養至約80%匯合度。隨后，將細胞以1×105細胞/mL的密度接種于24孔板中，并在培養板底部放置無菌蓋玻片。在細胞貼壁后，用PBS輕輕洗滌兩次，分別添加含有PBS、未修飾納米顆粒（NP）或LNA antigene-NP（200 nM LNA antigene濃度）的培養基，繼續孵育24 h。

1.2.6FAM熒光標記和攝取分析為分析LNA antigene-NP在HepG2肝癌細胞中的攝取效率，用FAM標記LNA antigene。處理后的細胞培養24 h后，移除培養基，用PBS洗滌兩次，并用4%多聚甲醛溶液固定10 min。固定后的細胞用PBS洗滌兩次，并用DAPI染色10 min，隨后用PBS洗滌以去除多余染料。最后，使用熒光顯微鏡觀察并記錄FAM和DAPI信號，通過合并兩種熒光信號來分析LNA antigene-NP在細胞內的分布情況。

1.2.7LNA antigene-NP的體外釋放動力學分析LNA antigene-NP的體外釋放實驗在模擬體液（PBS，pH 7.4）中進行。將一定量的LNA antigene-NP懸浮于含有0.5%（w/v）吐溫80的PBS中，置于37 ℃的恒溫搖床中（100 rpm）。在預定的時間點（2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24天），取樣并離心（12 000 rpm，4 ℃，10 min），收集上清液，用紫外-可見分光光度計測定260 nm處的吸光度，計算LNA antigene的累積釋放量。每個時間點的實驗均重復三次，取平均值，并繪制釋放曲線。

1.2.8動物模型與實驗分組本實驗使用HBV轉基因小鼠模型。動物實驗在右江民族醫學院附屬醫院提供的清潔動物房中進行，所有操作均符合Covance的要求及《實驗動物護理和使用指南》，并獲得右江民族醫學院附屬醫院倫理委員會批準（倫理批準編號：YYFY-LL-2023-121）。所有動物在符合條件的屏障環境中飼養，溫度維持在（22±2）℃，濕度控制在50%～60%，并提供12 h光暗周期。實驗前，所有小鼠適應性飼養一周。將8周齡雄性HBV轉基因小鼠隨機分為5組，每組6只小鼠，分別為：PBS對照組、低劑量組（0.5 mg/kg）、中劑量組（2 mg/kg）、高劑量組（5 mg/kg）和ETV陽性對照組（0.5 mg/kg）。

1.2.9LNA antigene-NP的給藥與處理三個劑量組通過尾靜脈注射LNA antigene-NP，劑量分別為0.5 mg/kg、2 mg/kg和5 mg/kg，注射體積為200 μL。ETV陽性對照組將ETV溶解于PBS中并以0.5 mg/kg的劑量口服灌胃給藥，PBS對照組則注射等體積的PBS溶液。各組小鼠均在每天相同時間點進行處理，連續給藥7天。

1.2.10血清HBV DNA的定量檢測在第1天、第3天、第5天、第7天通過眼眶采血法收集小鼠眼眶血約200 μL，使用4%EDTA溶液抗凝，離心（4 ℃，3000 rpm，10 min）后分離血清并保存于-80 ℃以備后續分析。通過熒光定量PCR（qPCR）檢測HBV DNA的抑制率，使用HBV DNA定量檢測試劑盒按照制造商說明書進行。

1.2.11血清HBsAg和HBeAg的定量檢測分別使用HBsAg定量檢測試劑盒和HBeAg定量檢測試劑盒檢測HBsAg和HBeAg的抑制率，依據制造商說明書，采用ELISA法測定。各項指標的抑制率計算基于對照組與處理組的差異。

1.3統計學方法實驗數據采用GraphPad Prism 9.0軟件進行統計分析，數據以平均值±標準差（±s）表示。兩組間差異采用獨立樣本t檢驗，多組間差異采用單因素方差分析（One-way analysis of variance，One-way ANOVA）。如果One-way ANOVA顯示顯著性差異，進一步采用Dunnett's檢驗進行多重比較。檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2結果2.1LNA antigene-NP的制備及其粒徑和表面電位特性分析PLGA納米載體的制備流程圖顯示LNA antigene與PLGA材料的聚合過程，成功制備LNA antigene-NP（圖1A）。NTA檢測結果顯示，未修飾NP的粒徑主要分布在100～200 nm之間，而LNA antigene-NP的粒徑分布則略有增加，集中在125～225 nm之間（圖1B）。Zeta電位檢測結果表明，LNA antigene-NP的表面電位（接近-30 Zeta電位）較未修飾的NP有所降低（-20 Zeta電位）（t=8.490，P＜0.001）（圖1C）。

2.2LNA antigene-NP納米粒子的包封率和載藥量LNA antigene的總投入量為8 OD（LNA antigene 10 OD=33 mg），PLGA總投入量為100 mg，納米粒子產物約 50 mg。計算納米粒子對LNA antigene的包封率為32%（n=3），載藥量為8.448 mg，載入率為16.90%。

2.3LNA antigene-NP在HepG2肝癌細胞中的攝取效率分析與PBS組相比，NP組的FAM信號有所增強。FAM信號的強度反映NP的攝取情況，表明部分NP被細胞攝取。而在LNA antigene-NP組中，FAM信號明顯增強，且在細胞質中均勻分布，顯示出LNA antigene-NP被細胞廣泛攝取，并有效進入細胞內（圖2）。

2.4LNA antigene-NP的體外釋放動力學分析LNA antigene-NP在0至24天內顯示出持續釋放的特點，其中在前4天釋放速率較快，釋放率達到約60%，隨后釋放速率逐漸減緩，在第8天時釋放率達到約80%，并在接下來的時間段內趨于平穩，最終釋放率接近90%（圖3）。

2.5LNA antigene-NP對轉基因小鼠HBV復制和抗原表達的抑制效果分析在LNA antigene-NP處理轉基因小鼠后的不同時間點，觀察到對HBV DNA、HBsAg及HBeAg的抑制效果存在劑量依賴性。在處理的第1天，各劑量組均顯示出一定程度的抑制效果，其中高劑量組（5 mg/kg）對HBV DNA的抑制率最高，隨后抑制效果逐漸增加并在第7天達到約40%；中等劑量組（2 mg/kg）顯示出中等抑制效果，HBV DNA的抑制率在第7天達到約20%；低劑量組（0.5 mg/kg）顯示出較低的抑制效果，HBV DNA的抑制率在第7天維持在約10%。第7天時，與0 mg/kg組相比，5 mg/kg LNA antigene-NP處理顯著提高了對HBV DNA的抑制率［F（4，10）=1057，P＜0.001，Dunnett's 檢驗P＜0.001］。然而，5 mg/kg LNA antigene-NP對HBV DNA的抑制率顯著低于ETV組［F（4，10）=1057，P＜0.001，Dunnett's檢驗P＜0.001］。見圖4A。

不同濃度LNA antigene-NP對HBsAg和HBeAg的抑制效果與HBV DNA的趨勢相似，高劑量組在第7天對HBsAg和HBeAg的抑制率均達到60%左右。第7天時，與0 mg/kg組相比，5 mg/kg LNA antigene-NP處理顯著提高對HBsAg的抑制率［F（4，10）=2984，P＜0.001，Dunnett's檢驗P＜0.001］，而對HBsAg的抑制率顯著低于ETV組［F（4，10）=2984，P＜0.001，Dunnett's檢驗P＜0.001］。見圖4B。同理，與0 mg/kg組相比，5 mg/kg LNA antigene-NP處理顯著提高對HBeAg的抑制率［F（4，10）=4202，P＜0.001，Dunnett's檢驗P＜0.001］，而對HBeAg的抑制率顯著低于ETV組［F（4，10）=4202，P＜0.001，Dunnett's 檢驗P＜0.001］。見圖4C。

3討論HBV是一種全球性健康威脅，其慢性感染可導致嚴重的肝臟疾病，包括肝硬化和肝細胞癌［2］。近年來，NP作為藥物遞送系統在HBV治療中取得顯著進展，通過提高靶組織的藥物濃度、延長釋放時間并減少全身副作用，從而顯著增強抗病毒效果［16］。例如，NP遞送的siRNA和mRNA已被證明能有效抑制HBV復制和抗原表達，顯示出清除感染的潛力［17-20］。本研究選擇LNA antigene這一特異性靶向HBV基因組的策略，并將其與PLGA-NP結合，旨在提高遞送效率和增強抗病毒效果。研究表明，PLGA納米顆粒的尺寸主要在300 nm以內，絕對Zeta電位接近20 mV［21］。納米顆粒跟蹤分析檢測結果顯示，LNA antigene-NP的粒徑分布（125～225 nm）略大于未裝載的PLGA-NP（100～200 nm）。本研究中LNA antigene的加入導致PLGA納米顆粒粒徑增大的現象，這與其他研究的發現一致，即siRNA納米顆粒的尺寸與載藥量和表面修飾密切相關［22］。

PLGA納米載體因其良好的生物相容性、可降解性和藥物遞送特性，廣泛應用于藥物遞送和基因治療領域。PLGA納米顆粒通過納米沉淀法自發組裝形成穩定的納米顆粒［23］。這一自發組裝過程可控制顆粒的粒徑、形狀和表面性質，從而優化其在體內的遞送效果。例如，調節制備條件可以實現PLGA-PEG納米顆粒的粒徑可調性，從而提高藥物遞送的可重復性和療效預測性［24］。此外，PLGA納米顆粒的自發組裝特性能夠包封大分子藥物或核酸，并通過調節降解速率實現藥物緩釋［25］。本研究的LNA antigene-NP表面電位接近-30 mV，表明其在水相環境中的穩定性良好。與文獻報道的PLGA-Lipid混合納米顆粒相比，這種PLGA納米顆粒也具有較低的表面電位，有助于其在體內循環中的穩定性［23］。本研究通過優化自發組裝過程，LNA antigene包封效率和藥物遞送特性得到了顯著提高，這可能與PLGA納米顆粒自發組裝形成的緊密聚合結構有關［26］。這種自發組裝納米顆粒在體外和體內均表現出良好的藥物釋放行為，呈現出典型的兩階段釋放模式［26］。研究表明，PLGA納米顆粒在核酸藥物遞送中具備良好的控制釋放能力，能夠實現初期快速釋放和后續持續釋放的雙重效果［27］。本研究中，LNA antigene-NP展現出類似的釋放特性，初期釋放較快，隨后趨于平穩，最終實現接近90%的藥物釋放。這種釋放模式與文獻報道的PLGA載體特性一致，表明LNA antigene-NP在控制藥物釋放方面具有潛力，為長效基因治療提供了前景。

此外，LNA antigene-NP在HepG2肝癌細胞中的攝取效率顯著高于未修飾的NP，這表明LNA antigene-NP能夠更有效地進入細胞并在細胞內分布均勻，提示LNA antigene-NP可能通過內吞途徑進入細胞。LNA antigene-NP不僅能夠有效抑制HBV DNA、HBsAg和HBeAg的表達，還在劑量依賴性方面表現出較強的抗病毒活性，這與先前研究中的NP遞送系統結果相一致。GAO等人［17］制備的PreS/2-21修飾的siRNA納米顆粒對HBV模型小鼠HBV DNA、HBeAg和 HBsAg的抑制率分別為24.43%、55.45%和38.79%，與本研究5 mg/kg LNA antigene-NP的抑制率（40%～60%）相似。這種顯著的抑制作用可能與LNA antigene通過與HBV基因組互補結合，阻斷病毒復制和轉錄有關［10］。然而，低劑量組的抑制效果相對較弱，這提示在臨床應用中需要精確控制劑量以達到最佳治療效果。

盡管本研究取得了較為積極的結果，但仍存在一些局限性。首先，LNA antigene-NP的包封率和載藥量仍有提升空間，這對進一步提高其治療效果至關重要。其次，本研究僅在轉基因小鼠模型中進行了初步驗證，尚未在其他動物模型或臨床前試驗中進行廣泛測試，因此其安全性和有效性仍需進一步評估。此外，本研究中的LNA antigene-NP制備工藝較為復雜，在實際生產和應用中可能存在一定挑戰，未來需要開發更為簡便和高效的制備方法。

總之，本研究通過納米載體技術成功制備LNA antigene-NP，并系統評估其在體外和體內的表現，結果顯示LNA antigene-NP具有良好的藥物釋放特性和顯著的抗HBV活性。盡管尚存在一些需要優化的方面，但該研究為LNA基因治療的進一步開發和應用提供了重要依據。未來，隨著納米載體技術的進一步發展，LNA antigene-NP有望成為一種安全有效的抗HBV基因治療新策略。參考文獻［1］ NASSER N， TONNERRE P， MANSOURI A， et al. Hepatitis-B virus：replication cycle，targets，and antiviral approaches［J］. Curr Opin Virol， 2023， 63：101360.

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（收稿日期：2024-08-28修回日期：2024-10-10）

（編輯：王琳葵 潘明志）