應用micro-CT和小動物高頻超聲成像系統評價實驗性類風濕關節炎

摘要：目的 "建立micro-CT和小動物高頻超聲成像系統評價實驗性類風濕關節炎研究標準。方法 "分別構建5只IL-1β拮抗劑敲除自發性關節炎小鼠和使用牛Ⅱ型膠原誘導為類風濕性關節炎（CIA）的SD大鼠。應用micro-CT對關節炎模型鼠的足趾進行成像掃描，分析骨體積分數（BV/TV）和骨表面積和組織體積的比值（BS/TV）等微觀參數。使用小動物高頻超聲成像系統對關節炎模型鼠的膝關節進行成像，檢測膝關節的回聲強度，并觀察膝關節是否有積液。結果 "Micro-CT可以清楚地檢測到關節炎模型鼠的足趾部位膨大和畸形，微觀參數BV/TV和BS/TV顯著降低（Plt;0.05）。小動物高頻超聲成像系統可以清楚地觀察到關節炎模型鼠膝關節存在積液，關節炎模型組膝關節灰度值量化反映的回聲強度顯著低于對照組（Plt;0.05）。結論 "應用micro-CT 和小動物高頻超聲成像系統分別對小動物的足趾和膝關節成像分析，可以系統地評價實驗性類風濕關節炎的發展水平，彌補實驗性RA成像缺乏統一標準的缺陷。

關鍵詞：micro-CT；高頻超聲成像系統；類風濕性關節炎；骨體積分數；回聲強度

Micro?CT and small animal high?frequency ultrasound were used to evaluate experimental rheumatoid arthritis

TSEDIEN Nhamdriel1， HOU Bao2， HUANG Shubing2， CAI Weiwei2， SUN Haijian2， Mi Ma1， QIU Liying2

1University of Tibetan Medicine， Lhasa 850000， China; 2Wuxi Medical College， Jiangnan University， Wuxi 214122， China

Abstract： Objective To establish the evaluation criteria of experimental rheumatoid arthritis by micro-CT and high-frequency ultrasound. Methods Five IL-1β knockout mice with spontaneous arthritis and five SD rats with rheumatoid arthritis （CIA） induced by bovine type Ⅱ collagen were constructed. Then， the toes of arthritis model mice were imaged by micro-CT， and the microscopic parameters such as BV/TV and BS/TV were analyzed. High-frequency ultrasound was used to image the knee joint of arthritis model mice to detect the echo intensity of the knee joint and observe whether there was effusion in the knee joint. Results Micro-CT could clearly detect the enlargement and deformity of the toes in the arthritis model mice， and the microscopic parameters BV/TV and BS/TV were significantly reduced. High-frequency ultrasound could clearly observe the knee joint effusion in arthritis model mice， and the echo intensity of knee joint gray value quantitative response in arthritis model group was significantly lower than that in control group. Conclusion The application of micro-CT and high-frequency ultrasound imaging analysis of small animal toes and knees can systematically evaluate the development of experimental rheumatoid arthritis， and compensate for the lack of unified standards in experimental rheumatoid arthritis imaging.

Keywords： micro-CT; high-frequency ultrasound; rheumatoid arthritis; BV/TV; echo intensity

類風濕性關節炎（RA）是一種全身性自身免疫系統性疾病［1-3］。隨著RA患者發病年限的增長，RA患者的骨關節畸形的風險越高，致殘率也越高［4-5］。因此較早且準確地診斷和干預治療有利于緩解RA病程的發展和骨損傷的程度［6-7］。醫學影像學方法常用于直觀地診斷和監測RA疾病的進展、評估療效及預后［8-9-］。目前顯微計算機斷層掃描技術（micro-CT）、MRI、靜息態功能磁共振成像技術（rs-fMRI）、PET/CT和超聲已被廣泛應用于人體疾病檢測。MRI作為非侵入性醫學影像技術，是診斷骨性關節炎的主要手段［10］，但需要專業醫師進行圖像數據標注，對圖像質量要求較高［11］；CT基于無創性高分辨率三維成像技術，可以對活體或者離體組織進行二維和三維層面的成像，并且可以直觀地觀察到骨損傷與骨畸形，分析骨密度流失和骨體積分數等微觀數據，精確反映RA的進展程度［12-13］；高頻超聲成像系統因其超聲頻率高，圖像分辨率也較高，可以實時動態無創地檢測RA病變的發展進程；灰階超聲可以檢測到骨關節腔積液，骨質破壞和滑膜增生［14］。

對于實驗性RA的研究對象主要涉及大鼠、小鼠和兔，對成像的分辨率具有較高的要求。MRI因其使用條件和專業的圖像分析醫師的限制，顯然不適合用于實驗性RA的研究。Micro-CT因其針對性的應用于小動物和離體組織的高分辨率成像，在評估實驗性RA方面存在天然的優勢，可以直觀地觀察RA骨畸形，精確分析畸形骨的微觀參數。小動物高頻超聲成像因其較高的超聲頻率，應用于小動物的實驗性RA研究，可以清楚觀察到骨損傷情況。雖然醫學影像學的發展十分迅速，但是對于實驗性RA導致的骨損傷影像評價并沒有統一標準［15］。本研究旨在通過micro-CT和小動物高頻超聲成像技術對實驗性RA導致的骨損傷成像建立研究標準， 系統的評價實驗性RA的發展水平，彌補實驗性RA成像缺乏統一標準的缺陷。

1 "材料與方法

1.1 "材料

小動物高頻超聲成像系統為Vevo[?]3100LT系統（Fujifilm），micro?CT為Quantum GX II成像系統（PerkinElmer），分辨率為36 、72和144 μm和的離體骨成像模式。

麻醉系統采用RAS-4 Rodent Anesthesia System，使用異氟烷麻醉劑；實驗動物：10只BALB/c背景的IL-1β拮抗劑敲除自發性關節炎小鼠隨機分為對照組和模型組，5只/組，8周齡體質量25±2 g。10只8周齡SD大鼠隨機分為對照組和模型組，5只/組，使用牛Ⅱ型膠原誘導為CIA關節炎模型大鼠，體質量為250±20 g，大鼠和小鼠由上海斯萊克實驗動物公司提供。本研究動物實驗經江南大學實驗動物倫理委員會批準（JN.No20230228S0250519）。

1.2 "超聲系統成像參數設置

超聲成像條件為：成像分辨率30 μm；頻率15～70 MHz；幀頻速度1000 frame/s；成像模式為B-Mode；成像探頭：小鼠使用MX400、大鼠使用MX250對膝關節進行成像。

1.3 "Micro-CT系統參數設置

Micro-CT檢測條件為：掃描電壓選擇90 kV，X射線濾光片為Cu 0.06 mm+Al 0.5 mm。電流88 μA，視野18 mm、36 mm和72 mm，分辨率36 μm、72 μm和144 μm，掃描模式為High Resolution，掃描時間4 min、角增量1.5°。對小鼠和大鼠足部進行全長和局部掃描。

1.4 "超聲系統成像方法

采用Vevo[?]3100LT小動物高頻超聲成像系統（Fujifilm）對小鼠和大鼠膝關節進行超聲成像。成像之前將小鼠和大鼠置于麻醉盒中預麻。在對大小鼠膝關節進行超聲成像的過程中，進行實時麻醉，防止實驗動物蘇醒。

1.5 "成像分析

對于micro-CT掃描大小鼠足部成像，由2位專業的醫學影像實驗師使用Analyze12.0對成像結果進行單獨定性和定量分析。分析內容包括骨體積分數（BV/TV）、骨表面積和組織體積的比值（BS/TV）、骨表面積和骨體積的比值（BS/BV）。使用小動物高頻超聲分析軟件Vevo LAB對大小鼠膝關節成像進行分析。

1.6 "統計學分析

采用Graph Prism 8.0軟件進行統計分析。所有實驗數據以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析和Dunnett檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 "結果

2.1 "應用micro-CT評價自發性RA小鼠骨損傷

對照組小鼠足部骨面光滑平整，但是RA模型組小鼠足部骨面開始出現顯著的畸形（圖1A），對RA小鼠骨面部位的BV/TV、BS/TV和BS/BV分析結果顯示，與對照組相比，模型組中BV/TV和BS/TV降低（Plt;0.01，圖1B）。

2.2 "應用小動物高頻超聲成像檢測自發性RA小鼠膝關節積液

在模型組中小動物高頻超聲成像顯示，RA小鼠膝關節內存在顯著的積液，對照組小鼠膝關節呈實質性區域且無積液（圖2A）。此外，對照組小鼠膝關節灰度值反映的回聲亮度值較高。而與對照組相比模型組小鼠膝關節灰度值量化反映的回聲強度顯著降低（Plt;0.05圖2B）。

2.3 "應用Micro-CT評價RA大鼠骨損傷

在模型組中CIA大鼠骨結開始膨大，足部骨面出現畸形（圖3A），而對照組骨面連續且平滑。對骨面部位的BV/TV、BS/TV和BS/BV分析發現，與對照組相比模型組中BV/TV和BS/TV也降低（Plt;0.01，圖3B），與IL-1β拮抗劑敲除自發性關節炎小鼠骨關節表現類似。

2.4 "應用小動物高頻超聲成像檢測RA大鼠膝關節積液

小動物高頻超聲成像顯示，模型組中膝關節積液較為顯著，呈低回聲深色區域（圖4A）；對照組中大鼠膝關節呈高亮的實質性區域。膝關節灰度值反映的回聲亮度值顯示，模型組膝關節灰度值低于對照組（Plt;0.01，圖4B）。成像結果與RA小鼠膝關節成像結果類似。

3 "討論

CT和超聲可以清楚直觀地觀察到關節炎患者關節處是否有積液存在，半月板是否退變以及滑膜的增厚程度。相較其他檢測手段，CT和超聲有著檢測速度快、無創、多維度觀察和精確的診斷等優勢［15］。當前應用micro-CT對實驗性關節炎模型鼠分析，主要有對軟骨下骨影像學的檢測與分析［16］、膝關節股骨遠端骨影像學的檢測與分析［17-18］、足趾骨侵蝕和關節破壞影像學的檢測和分析等［19-20］。本研究采用micro-CT觀察了IL-1β敲除自發性關節炎小鼠足部的三維立體結構，發現模型組中小鼠足部骨面開始出現畸形，深入分析發現，關節炎小鼠的足部骨面BV/TV和BS/TV顯著降低；繼續用micro-CT觀察牛Ⅱ型膠原誘導的大鼠CIA模型，發現與關節炎小鼠足部特征相同的結果。這表明無論是關節炎模型小鼠還是關節炎模型大鼠，micro-CT掃描結果都能直觀體現大小鼠足部骨畸形水平，并且深入分析可以發現足部BV/TV和BS/TV的微觀變化。因此應用micro-CT掃描RA大小鼠的足部，可以從宏觀何微觀同時評價實驗性類風濕關節炎的嚴重程度。

有學者采用micro-CT研究不同時期CIA大鼠骨損傷和BV/TV的變化，發現隨著RA的發展CIA發病大鼠軟骨表面完整性遭破壞，BV/TV減小，骨損傷加劇［21］。該研究結果與本研究結果相同，表明本研究結果的可靠性。有研究使用能量多普勒超聲可敏感地檢測兔關節模型中滑膜中血流信號，并進行量化分析，用于RA滑膜炎活動性評估［22］。但是實驗性RA模型通常以大小鼠為主，應用多普勒超聲檢測大小鼠滑膜中血流信號具有一定的難度。

隨著超聲分辨率的不斷提高和新技術的探索應用，高頻超聲成像系統能更敏感、更精確地發現RA患者外周關節的積液和滑膜炎癥［23-24］。目前，在臨床上超聲已廣泛應用于RA的發展進程的診斷和治療［25］，例如超聲引導關節腔內注射、超聲評價關節間間隙和膝關節滑膜超聲造影等［26， 27］。本研究通過小動物高頻超聲成像系統檢測IL-1β拮抗劑敲除自發性關節炎小鼠和CIA大鼠膝關節積液水平，并通過灰度值量化反映膝關節的回聲強度，結果表明小動物高頻超聲成像系統對關節炎小鼠和CIA大鼠膝關節的成像清晰，可以清楚地看到積液部位。通過灰度值量化反映的回聲強度得出，關節炎模型組膝關節灰度值顯著低于對照組。因此，應用小動物高頻超聲成像系統，可以評估實驗性類風濕性關節炎模型鼠的膝關節炎的發展水平。

實驗性RA因為其造模方法多種多樣，最終導致實驗動物的骨關節病變部位不同，因此選擇分析的骨病變區域也不同。對骨病變區域的分析方法也多種多樣，得出的結果也相差較大，無法對實驗結果進行橫向對比，這阻礙了RA的研究進展。本研究借助小動物micro-CT和小動物高頻超聲成像系統無創和高分辨率的成像特點以及對骨微觀病變分析的精確性等優點，建立實驗性RA導致的骨損傷成像研究標準，系統地評價實驗性RA的發展水平，彌補了實驗性RA成像缺乏統一標準的缺陷，助推RA的精準研究，早日解決RA患者的病痛。

綜上，應用小動物micro-CT掃描RA大小鼠的足部，可以從宏觀和微觀同時評價實驗性類風濕關節炎的嚴重程度。應用小動物高頻超聲成像系統，可以評估實驗性RA模型鼠的膝關節炎的發展水平。本研究為實驗性RA的探究提供了直觀、精確和科學的探索方法，為小動物micro-CT和小動物高頻超聲成像系統在實驗性RA的研究提供參考。

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（編輯：林 "萍）