基于網絡藥理學探究鹽敷方治療膝骨關節炎的作用機制*

江曉倩 張玉琴 滕海英

1 福建中醫藥大學附屬康復醫院,福建省福州市 350003; 2 福建中醫藥大學

膝骨關節炎(Knee osteoarthritis,KOA)是一種以關節軟骨退行性改變、滑膜炎癥反應、關節間室變窄和關節繼發性骨質增生為主要病理特征的慢性進行性骨關節病,是臨床常見的骨科疾病之一。KOA好發于40歲以上中老年人[1],隨著我國進入老齡化社會,KOA的發病人數也在與日俱增,總患病人數可高達3 000萬[2]。KOA在中醫學屬“痹證”“痿證”等范疇,國家中醫藥管理局將其命名為“膝痹”[3]。中醫痹病理論始于《內經》,《素問·痹論》首次提出骨痹、筋痹、脈痹的概念,中醫理論將其病因病機概括為肝腎虧虛、筋骨失養、氣血不足、風寒濕邪痹阻所致,具有本虛標實的特點[4]。

中藥外敷法是中醫骨傷科臨床治療膝骨關節炎診療指南中推薦的藥物療法之一,具有不良反應小、減輕關節疼痛效果明顯等優勢。目前臨床常用的外敷方功效多以活血化瘀、通絡止痛為主,將藥劑貼敷于患處或穴位肌膚具有增強軟骨細胞活力、促進其增殖、抑制炎癥和組織水腫、降低骨內壓、緩解疼痛等作用[5]?！胞}敷方”為福建中醫藥大學附屬康復醫院外用經驗方,其主藥成分有:乳香、沒藥、制吳茱萸、丁香、紫蘇子、炒萊菔子、大青鹽。本方具有活血行氣、祛寒止痹、通絡止痛的功效,與大青鹽合用可引藥入腎,攜藥滲透入里,從而增強藥效,在臨床上取得了較好的療效。

網絡藥理學的發展為探究中藥方劑的活性成分和潛在作用機制提供了一種新思路。本研究運用網絡藥理學的方法對鹽敷方治療膝骨關節炎的分子作用機制進行探討,為后期鹽敷方作用機制的研究提供了理論參考。

1 方法

1.1 鹽敷方有效成分收集及藥物靶點預測 以乳香、沒藥、制吳茱萸、丁香、紫蘇子、炒萊菔子作為檢索詞在 TCMSP 數據庫[6](https://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索,獲得這6味中藥的化學成分信息,將篩選條件設置為生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL值)≥0.18[7],篩選出鹽敷方中符合條件的活性成分。再通過Uniprot(https://www.Uniprot. org/) 數據庫[8]對搜集的六味中藥活性成分所對應的靶點進行名稱校正。

1.2 構建膝骨關節炎—靶點基因預測 在Disgenet(https://www.disgenet.org)[9]與Drugbank(https://go.drugbank.com)數據庫[10]中以“knee osteoarthritis” “osteoarthritis,knee”為關鍵詞,種屬選擇“Homo sapiens”篩選與疾病相關的靶點,將兩數據庫搜索結果合并去重,獲得疾病靶點基因。

1.3 獲取交集基因及網絡構建

1.3.1 構建鹽敷方成分靶點網絡圖。運用cytoscape3.10.0軟件導入鹽敷方中各組分的化學成分及所對應的靶點基因,構建鹽敷方成分—靶點網絡。

1.3.2 構建鹽敷方—膝骨關節炎共同靶點網絡。將鹽敷方活性成分作用靶點和膝骨關節炎靶點基因取交集,獲得鹽敷方與膝骨關節炎的共同靶點。

1.4 構建蛋白相互關系網絡(PPI) 將獲得的共同靶點導入 String 數據庫[11](https://string-db.org),物種設定為“Homo sapiens”,其他篩選條件選擇默認參數,從而構建鹽敷方治療膝骨關節炎共同靶點蛋白可視化網絡。

1.5 GO富集分析及KEGG富集分析 將“鹽敷方—膝骨關節炎”中共同靶點導入到 Metascape(https://metascape.org)[12]中進行通路富集分析。在Metascape的基因面板中粘貼基因列表,將物種限定設置為人類(Homo sapiens),后進行GO富集分析和KEGG信號通路富集分析。富集條件設置為P<0.01,重疊值(Overlap)≥3,富集值(Enrichment)≥1.5。GO分析的過程主要包括三個方面:生物過程分析(BP)、細胞成分分析(CC)、分子功能分析(MF)。最后利用微生信網站對結果進行可視化。

2 結果

2.1 鹽敷方的成分及作用靶點 運用TCMSP數據庫共篩選出鹽敷方組方的94個活性成分,其中乳香6個,沒藥34個,紫蘇子14個,吳茱萸32個,丁香6個,萊菔子2個,剔除重復項后獲得86個活性成分。通過Uniprot數據庫對TCMSP數據庫檢索出的鹽敷方組方中活性成分所對應的作用靶點進行名稱校正后,共獲得255個活性成分作用靶點。

2.2 膝骨關節炎的作用靶點 通過檢索Disgenet與Drugbank數據庫,以“knee osteoarthritis”“osteoarthritis,knee”為關鍵詞進行檢索,兩個數據庫所得的靶點信息整合、去重后,總共獲得415個疾病靶點。

2.3 構建鹽敷方活性成分—膝骨關節炎共同靶點網絡 將鹽敷方活性成分作用靶點和膝骨關節炎靶點基因取交集,篩選出鹽敷方與膝骨關節炎的共同靶點51個,這些靶點為鹽敷方治療膝骨關節炎的潛在作用靶點。這51個靶點對應的鹽敷方活性成分共有54個,導入cytoscape3.10.0軟件,構建“鹽敷方活性成分—共同靶點網絡圖”,見圖1。

圖1 鹽敷方活性成分—共同靶點網絡圖

2.4 PPI網絡的構建 通過String數據庫在線構建的鹽敷方活性成分和膝骨關節炎共同靶點的PPI網絡包含51個節點和608條線將這些節點相連接,見圖2。將這51個共同靶點按照自由度(degree)值進行排序,排名前十的靶點為TNF、IL-6、IL-1β、ALB、PTGS2、CCL2、MMP9、TP53、HIF1A、IL-10,其中TNF、IL-6的自由度值最高,均為45。表明這些靶點為鹽敷方治療膝骨關節炎的核心靶點,可能在鹽敷方治療膝骨關節炎中發揮核心作用。

圖2 鹽敷方—膝骨關節炎共同靶點PPI網絡圖

2.5 GO與KEGG 富集分析

2.5.1 GO富集分析。GO功能富集分析共涉及882條生物過程、26種細胞組分、78個分子功能,根據基因富集程度進行排序,列舉排名前十位的功能,并繪制三合一氣泡圖,詳見圖3。結果顯示:(1)鹽敷方治療膝骨關節炎的生物過程通路(BP)主要富集于炎癥反應(inflammatory response)、炎癥反應的調節(regulation of inflammatory response)、細胞對脂質的反應(cellular response to lipid)、細胞運動的正向調節(positive regulation of cell motility)等。(2)細胞成分分析(CC)主要涉及膜筏(membrane raft)、膜微區(membrane microdomain)、血小板顆粒腔(platelet alpha granule lumen)、血小板α顆粒(platelet alpha granule)等細胞成分。(3)分子功能分析(MF)主要涉及細胞因子活性(cytokine activity)、信號受體調節活性(signaling receptor regulator activity)、細胞因子受體結合(cytokine receptor binding)、受體配體活性(receptor ligand activity)等分子功能。

圖3 鹽敷方—膝骨關節炎共同靶點GO富集分析圖

2.5.2 KEGG富集分析。KEGG 通路富集分析共獲得119個條目,對富集基因最多的前20條信號通路進行可視化,見圖4。與膝骨關節炎相關的KEGG通路主要涉及:IL-17(IL-17 signaling pathway)、腫瘤壞死因子(TNF signaling pathway)、類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis)、核因子κB(NF-kappa B signaling pathway)等信號通路。

圖4 鹽敷方—膝骨關節炎共同靶點 KEGG通路富集分析圖

3 討論

膝骨關節炎是一種關節軟骨退行性病變,嚴重影響患者生活質量。其病理特征隨病程變化,所受累組織不同而呈現出多方面的改變,包括軟骨下骨增生硬化、關節軟骨退變、骨贅形成、滑膜增厚等[13]。當前研究顯示KOA的發病機制尚不明確,其病機主要包括軟骨退變、軟骨下骨代謝異常、滑膜炎癥等[14]。“鹽敷方”熱敷外用可起到擴張血管、改善局部血液循環、消除炎癥、改善關節功能、減輕疼痛的作用,具有療效確切、不良反應少、可用于長期治療等優點。但由于缺乏動物實驗數據支持及其作用機制尚未明確,使得其難以廣泛推廣運用于臨床。

文章采用網絡藥理學的分析方法,對“鹽敷方”進行了數據庫層面的機制探究。根據PPI網絡分析結果可知,TNF、IL-6、IL-1β、ALB、PTGS2、CCL2、MMP9、TP53、HIF1A、IL-10等為關鍵靶點基因?；颊哐寮盎そM織中的腫瘤壞死因子TNF、白細胞介素因子IL-6、IL-1β是評價藥物治療膝骨關節炎療效的重要指標。研究表明,TNF、IL-6、IL-1β、IL-10可激活機體產生炎癥反應,是參與KOA病程發展的關鍵炎癥因子[15-16]。TNF可影響軟骨細胞的生成與凋亡,可分解代謝軟骨組織,導致關節軟骨的破壞[17]。 IL-1β不僅可以獨立誘導軟骨細胞炎性損傷[18],還可刺激COX-2、iNOS等的產生,激活炎癥途徑從而誘導炎癥性疼痛[19]。IL-6可加快生成IL-1β,破壞軟骨組織中TIPM和MMPs的平衡,使細胞外基質結構失衡,從而破壞關節軟骨[20]。環氧合酶PTGS2亦是炎癥反應重要靶點,通過將花生四烯酸轉化為 PGH2 從而誘導炎癥[21]。基質金屬蛋白酶9(MMP9)可通過降解軟骨基質中的膠原蛋白和蛋白多糖等成分,而誘導軟骨細胞發生凋亡壞死,從而導致加重炎癥反應[22]。由此推測,鹽敷方可通過調控炎癥因子、誘導軟骨細胞的生成與凋亡等途徑,改善膝骨關節炎。

GO分析發現,鹽敷方治療膝骨關節炎主要涉及炎癥反應、炎癥反應的調節、細胞對脂質的反應等生物過程?；ぱ装Y是膝骨關節炎重要病理表現之一,鹽敷方可通過參與炎癥反應與炎癥反應的調節,改善滑膜組織炎癥。在KOA的早期階段,就可以觀察到脂質沉積在關節腔內[23]。研究表明,脂質與炎癥反應息息相關。棕櫚酸可通過TLR4-ERK1/2-c-Jun信號通路增加軟骨細胞中IL-26的表達,促進炎癥反應[24]。抵抗素可通過MEK/ERK信號通路,促進關節滑液中IL-1β和TNF-α的表達,激活炎癥反應[25]。

KEGG富集通路分析結果顯示,鹽敷方治療膝骨關節炎主要涉及IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、類風濕關節炎信號通路、核因子κB信號通路等。IL-17、TNF、NF-κB信號通路都是與KOA病程發展密切相關的炎癥信號通路。研究表明,IL-17信號通路可通過誘導釋放炎癥因子,提升中性粒細胞的趨化能力,降低相關酶的活性,引起炎癥反應的加劇和關節軟骨的破壞[26-27]。同時,IL-17信號通路能夠異常激活NF-κB途徑中的炎癥因子,調控促炎性細胞因子TNF、IL-6、IL-1β等的表達,增強炎癥反應,加重關節軟骨的損傷[28-30]。TNF信號通路中的TNF-α不僅可誘導產生大量炎癥,同時可以激活NF-κB信號通路,誘導產生基質金屬蛋白酶MMP,從而加速軟骨的破壞[31]。由此推測,鹽敷方可通過調控多條炎癥信號通路從而治療膝骨關節炎。

綜上所述,通過網絡藥理學方法可得鹽敷方治療膝骨關節炎具有多靶點、多途徑的特點,可通過下調細胞因子表達、抑制炎癥反應、減慢軟骨降解退變來延緩KOA的發展。文章對鹽敷方作用機制進行了數據庫水平的分析,為后續研究奠定了堅實的理論基礎,接下來我們將對鹽敷方如何調控細胞因子表達及其更深層次的抗炎機制進行實驗研究。