GSK-3β在病理性疼痛中的研究進展

過琛璐 謝 敏 熊 麗

湖北科技學院醫學部藥學院,湖北省咸寧市 437100

病理性疼痛即慢性疼痛是一種很普遍的公共衛生問題,給患者的生活和活動能力造成了不良影響,同時產生很大的社會經濟負擔。病理性疼痛分為三大類:可分為由組織疾病或損傷引起的傷害性炎癥性痛(如骨關節炎)、由軀體感覺系統疾病或損傷引起的神經性疼痛和癌癥引起的癌痛三類[1]。病理性疼痛在臨床上會使患者伴有焦慮、抑郁等負面情緒。目前現有的藥物治療有加巴噴丁、普瑞巴林等,但藥物無法充分控制疼痛,并伴有各種副作用。對病理性疼痛的機制缺乏了解是易引起這些藥物副作用的主要原因,因此,闡明這些機制很重要[2]。

糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase 3,GSK-3β)最初于1980年從兔骨骼肌中純化出來,其表征為一種激活三磷酸腺苷/鎂依賴性蛋白磷酸酶和磷酸化糖原合酶 (GS) 的酶。它在神經退行性疾病、糖尿病、炎癥性疾病及癌癥中都有重要的意義。GSK-3作為蛋白激酶,正常條件下是有活性的,通過底物磷酸化來調節細胞生理活性。GSK-3β的Ser9位點磷酸化時,GSK-3β 活性下調,Tyr216 位點磷酸化時 GSK-3β 被激活[3]。在神經膠質細胞的研究顯示, GSK-3β活性上調后,對炎性細胞因子的表達具有促進作用,對抗炎因子 IL-10 等的表達具有抑制作用。在大鼠皮質膠質細胞中,GSK-3β 在星形膠質細胞和小膠質細胞中均有表達,LPS誘導大鼠皮質膠質細胞后,促炎細胞因子增加,發現用小分子抑制劑 SB216763 或情緒穩定劑氯化鋰抑制 GSK-3可減少促炎細胞因子(IL-1β和TNF-α)的產生,并增加體外抗炎細胞因子(IL-10)的產生[4]。上述結果證明GSK-3β可作為大腦中炎性細胞因子水平的調節劑,通過藥物抑制GSK-3β調節其活性并有助于從機制上了解以神經炎癥為特征的神經病理性疼痛。

1 GSK-3β的生物學特性

GSK-3是一種絲氨酸/蘇氨酸 (S/T) 蛋白激酶,它是絲裂原活化蛋白 (MAP) 激酶家族的一部分,在許多信號級聯中起關鍵作用。早期的研究表明GSK-3β在調節糖原代謝中發揮重要作用,是胰島素信號轉導的分子之一。進一步的研究結果發現,GSK-3β在炎癥反應、在氧化應激以及癌癥中也起著關鍵作用。GSK-3β是GSK-3的兩個經典的亞型之一,在結構上高度保守。大多數關于GSK-3 的研究都集中在使用化學抑制劑的β異構體上,化學抑制劑不區分 α 和 β 異構體[5]。GSK-3β抑制劑已被證明對許多神經炎癥疾病模型有益,包括阿爾茨海默病[6]、多發性硬化癥和AIDS癡呆癥等。鋰是臨床上用于治療雙相情感障礙的常用治療藥物,是一種 GSK-3β 抑制劑[7]。據報道,鋰是治療神經性疼痛的有效藥物,例如,由部分坐骨神經結扎或坐骨神經慢性縮窄性損傷引起的熱痛覺過敏和機械異常性疼痛可通過全身施用鋰或鞘內施用鋰來減輕病理性疼痛。Tideglusib是一種非ATP競爭性GSK-3β抑制劑,已在人類膠質母細胞瘤的異種移植物和PDX鼠模型中進行了測試[8]。在福爾馬林注射誘導的炎性疼痛模型中使用GSK-3β抑制劑NP031115使 GSK-3β 失活從而改善小鼠機械痛閾和冷痛閾[9]。GSK-3β抑制劑的研究及應用,為疾病治療的靶點提供了可能。

2 GSK-3β參與病理性疼痛

病理性疼痛通常由非疼痛(異常性疼痛)或疼痛(過度反應)刺激引起,常伴有自發性疼痛、疼痛超敏及觸誘發痛。有研究認為,該病通過神經功能缺損導致初級感覺神經元敏感,腦干、脊髓和大腦皮層的興奮性突觸傳遞增強,從而導致慢性疼痛[10]。外周和中樞敏化是導致病理性疼痛的主要機制。在很多病理性疼痛模型中,損傷部位、背根神經節和脊髓背角都有助于病理性疼痛的產生和維持。同時神經膠質細胞在病理性疼痛中的作用也引起了人們的重視。外周和中樞神經系統中也有GSK-3β的表達,在大腦中,GSK-3β主要定位于神經元[11],但也被證明存在于神經膠質細胞中[12]。膠質細胞激活和隨后釋放的促炎細胞因子在病理性疼痛的發生和維持中起著至關重要的作用。在嗎啡誘導的大鼠模型中,GSK-3β 抑制改變了脊髓背側腰椎對嗎啡的耐受性。GSK-3β 抑制劑SB216763 以劑量依賴性方式降低對嗎啡的藥理學耐受性,同時發現嗎啡的耐受性與GSK-3β的活性有關,當持續性的鞘內給藥會增加GSK-3β 的 Ser9 位點殘基的磷酸化從而降低嗎啡耐受性,阻止脊髓傷害性感受[13]。在乙酸誘導腹部收縮之前用GSK-3β 抑制劑(AR-A014418)進行腹膜內預處理可以減少扭體。在福爾馬林誘導的小鼠模型中通過腹膜內、足底內和鞘內注射用GSK-3β 抑制劑,進行預處理可降低福爾馬林誘導傷害感受后的舔舐頻率[9]。該研究表明 GSK-3β 的藥理學抑制可能在傷害感受和疼痛中起作用。在周圍神經損傷引起的神經性疼痛小鼠模型中腹腔內給予 GSK-3β 抑制劑 (AR-A014418) 可產生抗痛覺過敏作用并降低脊髓腰部(L1～6)中的促炎細胞因子 IL-1β和TNF-α,隨著機械性痛覺過敏的發展,單次腹膜注射GSK-3β 抑制劑可減輕機械性和熱性痛覺過敏[14]。這些數據表明 GSK-3β 可能是開發用于治療神經性疼痛的鎮痛劑的潛在靶標。

2.1 GSK-3β與炎癥的關系 許多研究表明,病理性疼痛與炎癥系統的激活和免疫系統的改變有密切聯系。組織中的炎癥介質作用于傷害性神經末梢,來降低神經元興奮閾值并提高傳入放電頻率,從而分別導致異常性疼痛和痛覺過敏的產生。而臨床研究也表明,關節炎患者血液中含有大量的炎性因子,比如,腫瘤壞死因子(TNF)和白細胞介素6(IL-6)等在內的促炎細胞因子大量產生,會導致NF-κB和 MAP的快速激活,從而控制聚集蛋白聚糖酶的生物利用度和神經生長因子(NGF)的調節,進而引起疼痛[15]。在神經炎癥中神經膠質細胞(包括星形膠質細胞和小膠質細胞)大量激活是抵御入侵病原體或損傷相關產物的第一道防線。在神經膠質細胞中的研究發現, GSK-3β 活性上調后,激活的膠質細胞會釋放大量的神經活性物質和促炎細胞因子。然而這些炎癥物質會作用于突觸末梢,使傷害性神經遞質(如SP、EAAs、神經營養因子、趨化因子等) 大量釋放,作用于痛覺神經元,使其敏感性和反應性增強,產生并維持病理性疼痛。由LPS刺激的小膠質細胞的神經炎癥中,虎杖苷的治療就是通過激活BV-2細胞中的AKT/GSK3β-Nrf2 信號軸發揮抗炎作用。GSK-3β作為炎癥信號的調節劑,在多種神經系統疾病的外周和中樞神經系統炎癥中已被廣泛研究。也可以說,GSK-3β是炎癥的有效驅動因子,它的增加能夠影響病理性疼痛,具有酶活性的GSK-3β是可以促進促炎細胞因子以及其他促炎介質的釋放。然而,GSK-3β也會導致炎癥的表達量減少,與抗炎作用有關。GSK-3活性的負調節似乎可以控制炎癥消退的調節,即當Ser9 磷酸化使得GSK-3β失活或者使用抑制劑的方式能夠緩解炎癥因子的釋放。從大量研究中確定,GSK-3β中 Tyr216和Ser9 位點之間的激活決定了其活性,磷酸化N端Ser9殘基導致 GSK-3β的自動抑制[16]。Ser9 的磷酸化阻止 GSK-3β與其底物結合,從而抑制GSK-3β的活化。有數據表明,ghrelin 可以通過抑制CCI大鼠脊髓中β-catenin 的表達,通過抑制GSK-3β活化來顯著減輕神經性疼痛[17]。GSK-3α敲除(KO)小鼠存活正常、表現出代謝性表型、異常神經元發育和加速衰老而在GSK-3βKO小鼠在胚胎發生晚期或出生時死亡[18]。但在組織特異性GSK-3βKO 模型中也對炎癥過程產生了影響。在缺血再灌注小鼠模型中,一種骨髓特異性 GSK-3β(KO)菌株,已經研究證實 GSK-3β在小鼠肝臟的促炎免疫反應減少, 但抗炎免疫反應增強[19]。

2.2 GSK-3β與神經性疼痛的關系 由病變或疾病引起的神經性疼痛,比如中樞神經性疼痛中的脊髓損傷、多發性硬化癥、周圍神經性疼痛中帶狀皰疹后神經痛、糖尿病、三叉神經痛等。GSK-3β在神經保護中起主要作用。研究表明,在糖尿病狀況期間,GSK-3β水平顯著降低,并且用氯化鋰治療后顯示神經元中GSK-3α/β 中的磷酸化Ser21/9水平增加據報道,糖原合成酶激酶 3 (GSK3) 的特異性抑制劑 AR-A014418可減少神經性疼痛[14]。丙戊酸鹽(VPA)是治療癲癇和躁狂癥的藥物,在大鼠坐骨神經慢性縮窄損傷(Sciatic nerve chronic constriction injury, CCI)模型的術后3d和14d會使坐骨神經(SN)、背根神經節(DRG)和脊髓(SC)中pAkt 和pGSK-3β/GSK-3β蛋白表達持續增加,且在第7天達到最高,當從術后第1天到第14天腹膜內注射 VPA[300mg/(kg·d)],VPA 顯著降低其表達。因此,認為pAKT/pGSK-3β 可能在神經性疼痛發展和維持的病理生理學中有重要作用。簡而言之,GSK-3通過調節GSK-3β的Ser9磷酸化,可使 GSK-3β 失活在神經保護中起主要作用。雖然GSK-3β在調節炎癥因子的表達中有重要的作用,但是也有很多學者研究發現,GSK-3β通過調控內質網應激 (Endoplasmic reticulum stress, ERS) 參與了神經病理性疼痛的形成。內質網應激在神經元細胞功能障礙和凋亡有重要調節作用,其主要有三個傳感器:肌醇依賴的跨膜激酶1(IRE1)、蛋白激酶RNA樣內質網激酶(PERK)和活性轉錄因子6(ATF6)。由這三種應激受體介導的未折疊蛋白反應(Unfolded protein response, UPR),在炎癥、缺氧、糖代謝異常等刺激時會啟動。內質網應激反應發生初始階段,異常蛋白優先競爭性地與免疫球蛋白BIP合,所以BIP 的轉錄激活已被廣泛用作 UPR 啟動的標準指標。在L5脊神經結扎(SNL)誘導的大鼠神經性疼痛模型中,使用脊髓背角中的特異性抗體通過免疫組織化學分析檢測 L5SNL誘導同側腰背角淺層BIP上調,以及后腰背角BIP mRNA表達和XBP1剪接增加等,表明在SNL模型中ER應激和未折疊蛋白反應(UPR)激活。當注射ATF6 siRNA瞬時沉默UPR信號通路的功能,發現在ATF6 siRNA注射后3、5、9d,與對側爪相比,同側爪的站立期持續時間從40.54%恢復到26.56%,ATF6 siRNA的鞘內注射減輕了機械超敏反應。因此,ER應激損傷在SNL模型中神經性疼痛發展中有重要作用, 內質網應激可能與神經性疼痛的誘導和維持有關。

2.3 GSK-3β與癌性痛的關系 癌癥是全球第二大死因,由于人口老齡化和不健康生活方式的出現,癌癥發病率迅速上升。疼痛是癌癥中最常見和最嚴重的癥狀之一,會干擾患者生活的各個方面,包括日?；顒印⑸缃还δ?、睡眠質量和認知功能。癌性疼痛常見原因包括癌腫本身和其轉移到骨骼、內臟或神經所產生的疼痛,以及抗癌藥物引起的組織或神經損傷有關的疼痛。AKT/GSK-3β通路是腫瘤細胞賴以生存的關鍵通路,在直腸癌SW620細胞中給予藥物楊梅素可降低P-AKT和P-GSK-β的表達,遏止AKT/GSK-3β通路導致直腸癌SW620細胞凋亡[20]。骨轉移所致疼痛是癌性疼痛常見的疼痛,是一種復雜的疼痛狀態,通常是持續的、突然的、自發的,且常伴有痛覺過敏。為了研究癌性疼痛的機制,最常用的動物模型是骨癌痛模型。在骨癌疼痛模型中,kenpaullone(KP)是一種GSK-3/cyclin-依賴性激酶(CDK)抑制劑,在腹腔注射30mg/kg KP時觀察到在10d和14d時骨癌痛顯著減輕,其背后的機制可能是通過 δ-catenin抑制 GSK-3β 和隨后增強Kcc2基因表達,從而降低神經元內的氯化物水平并重建正常的 GABA 能抑制功能,使得破壞的抑制性神經傳遞重新正?；?從而減少了骨癌小鼠模型中的病理性疼痛樣行為,為癌性痛的研究提供了重要的研究方向。

綜上所述,在病理性疼痛機制中,GSK-3β通過底物磷酸化等各種復雜的相互作用,調控相關基因蛋白,使得在病理性疼痛模型中緩解其疼痛,為病理性疼痛的治療提供重要的靶點。但GSK-3β在病理性疼痛的研究在臨床上還未得到廣泛的應用,對其在分子機制的闡述有助于該疾病在今后得到更好的治療和控制。