DNA分子標記技術在口腔微生物研究中的應用

都佳寅 王 寧 閆 卉

1 天津市南開醫院口腔科 300110; 2 天津中醫藥大學附屬第二醫院口腔科

長期以來,微生物研究的主要手段依賴純培養技術。據文獻報道,環境中只有約5%的微生物能夠被分離和純化,而口腔中可培養的細菌也只占50%。因此,用傳統的微生物培養和鑒定方法不足以反映生態環境中的真實情況,嚴重限制了認識口腔微生物的視野。近年來,現代分子生物學技術的成熟為微生物生態學研究提供了新的方法,促進了口腔微生物學研究的進一步發展[1]。常見的技術有限制性片段長度多態性標記技術(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)、變性梯度凝膠電泳(Denatured gradient gelelectrophoresis,DGGE)及隨機擴增多態性DNA標記(Random amplified polymorphic DNA,RAPD)等。如何提取高質量的DNA,同時最大限度地減少DNA的損失,是成功應用這些技術的關鍵問題。由于不同細菌樣本所含細菌的種類及數量不同,同一樣本采用不同的DNA提取方法所得結果可能不同。因此,許多學者針對不同的樣本特性,制定了各種具有針對性的DNA提取方法,以滿足不同實驗目的的需要,并減少假陽性或假陰性結果的產生。目前,對于口腔致病菌DNA的提取,不同的實驗選擇不同的方法,因此所得結果的可比性較差。本文綜述目前常見的應用于口腔的分子標記技術,為口腔微生物不同的研究目的和需求選擇合適的技術提供參考。

1 限制性片段長度多態性標記技術

限制性片段長度多態性標記技術(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)是指樣品DNA被限制性內切酶酶切產生的DNA片段長度的變異性。傳統RFLP技術的基本原理是用限制性內切酶消化樣品基因組DNA,產生大量限制性片段,不同樣品限制性片段的長度及數目不同,電泳后得到特異性圖譜,再結合Southern雜交,檢出RFLP。目前,該技術有兩種改進方法,PCR-RFLP和末端限制性片段長度多態性技術(T-RFLP),以克服對基因組酶切后形成過于復雜的條帶難于分析的問題。PCR-RFLP酶切經PCR擴增的特異性DNA片段。T-RFLP是在PCR-RFLP基礎上對引物的5'端用熒光物質標記,得到帶有熒光標記的末端限制性DNA片段(Terminal restriction DNA fragments,T-RFs),用DNA自動測序儀進行檢測獲得峰值圖,了解群落的組成、某菌種的相對數量及樣品之間的相似性等[2]。

PCR-RFLP和T-RFLP技術的核心問題在于引物—酶組合的選擇,不同的組合影響圖譜的特異性,在近源菌種鑒別時更為重要[3]。T-RFLP技術所得圖譜無法進行雜交或直接克隆分析。在分析近緣微生物時,當擴增片段靠近熒光標記端的切點一樣時,無法鑒定至種甚至是屬的水平。可分別應用幾種內切酶對同一分析樣品分別進行消化,綜合分析多個圖譜,提高檢出率。

2 單鏈構象多態性技術

單鏈構象多態性技術(Single-stranded Conformational Polymorphisms,SSCP)是基于DNA構象差別來檢測多態性的方法?；驹硎遣煌膯捂淒NA具有序列特異性,形成的空間構象不同,在非變性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速率不同,得到不同的電泳圖譜。

SSCP的主要優點是操作簡便、成本低、適合大樣本篩查;引物無須GC夾,也不需要灌制梯度凝膠;在100～300bp的單鏈DNA點突變檢出率可達97%,而300～450bp時的檢出率僅為67%[4];同時該技術不能預測單鏈DNA遷移速度,難以估計其凝膠中的條帶位置;不能識別突變位置,且當堿基互換不影響單鏈DNA的空間構象時,其檢出率只有57%[5]。有學者利用裂解酶片段長度多態性技術(Cleavase fragment length polymorphism,CFLP),RFLP-及SSCP-PCR三種方法檢測結核分枝桿菌的基因突變,SSCP和CFLP可檢測短目標序列中的所有突變,CFLP在檢測長目標序列中的突變時也非常具有優勢[6]。

3 變性梯度凝膠電泳

基本原理為變性梯度凝膠電泳(Denatured gradient gelelectrophoresis,DGGE)時,不同序列的DNA片段在各自相應的變性劑濃度下變性,使其在聚丙烯酰胺中的電泳速度急劇下降,停留在相應的變性劑梯度位置,染色后在凝膠上獲得條帶圖譜。電泳條帶的數目、位置和強度即可反映樣品中微生物的種類及相對構成比。

目前,該技術在口腔微生物研究中該技術被廣泛應用,具有加樣量小、分辨率高、重復性好、成本低、操作簡便快速等優點。DGGE通常根據細菌16SrDNA序列中保守區設計通用引物,對可變區做PCR擴增。但16SrDNA更適對屬以上進行分類,對于屬內種間分類分辨率較低。T?pp等[7]利用鏈球菌屬的rnpB基因序列對鏈球菌49個菌屬的79個菌株進行了分類鑒定,認為其序列的差異可用于菌種區分。為提高DGGE對序列差異的分辨率,通常在引物的3’端加上30～50個堿基“G-C夾板”,從而顯著提高長度超過500bp的DNA序列差異的檢出率。此外,通過圖譜分析軟件對條帶位置和強度進行分析,所得結果不能直接反映樣品的數量,只反映彼此的相對數量趨勢且往往存在誤差,需要結合雜交技術或測序分析等得到更詳盡的信息。Hakim等[8]研究發現DGGE只能對微生物群落中數量超過1%的優勢種群進行分析;PCR擴增所需G-C堿基對含量至少達40%。

4 核糖體基因間隔序列分析

除16SrDNA,原核生物DNA中還有5SrDNA和23SrDNA。編碼這些rRNA的基因按順序排列在一條核DNA上,其編碼順序為16S、23S和5SrRNA。核糖體基因間隔序列分析(Ribosomal intergenic spacer analysis,RISA)技術研究位于16SrRNA和23SrRNA基因間的間隔區序列(Intergenic Spacer Region,ISR),其中還含有編碼tRNA的tDNA序列,對其進行擴增稱為tDNA-PCR技術。不同種屬細菌間的基因間隔序列存在差異,同一菌種不同菌株的ISR不同,因此RISA技術被廣泛用于菌種的亞分類以及近源種研究中,表現出更顯著的序列尤其是長度多態性[9]。

該方法敏感性高,重復性好,與DGGE相比,RISA的引物無須GC夾。有時染色并不敏感,分辨率較低。有學者采用RISA結合異源雙鏈核酸分子分析技術研究牙齦卟啉單胞菌基因多態性,認為基于rNDA操縱子的ISR可更好地鑒定不同菌株,并同時從混雜菌群中鑒定特定菌種內的一系列菌株[10]。

5 RAPD-PCR、任意引物PCR標記技術(Arbitrary primer PCR,AP-PCR)和基因組重復序列PCR(Repetitive-element PCR,rep-PCR)

許多文獻將AP與RAPD歸為同一種技術?；驹碓从诨蚪MDNA分子內部存在間隔的顛倒重復序列(Inverted repeat),因此在兩條模板單鏈上各有一個隨機引物的結合部位,經PCR后產生若干單引物擴增產物,由于不同DNA的顛倒重復序列數目及間隔長度的差異,經凝膠電泳產生特異圖譜。兩者的主要區別在于:所需隨機引物長度不同,AP通常需要第三個引物,如M13通用引物,第一個PCR循環所需引物濃度較高;AP技術PCR過程分為兩個階段。首先在不嚴格的條件下使引物與模板錯配復性,形成可擴增序列,然后在嚴格條件下擴增,電泳后產生指紋圖譜;基于DNA重復序列的標記技術包括腸桿菌基因間保守重復序列標記(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR,ERIC-PCR)、基因外重復回文序列PCR標記(Repetitive extragenic palindromic sequence PCR,REP-PCR),BOX-PCR標記及腸炎沙門氏菌重復序列PCR標記(Salmonella serotype Enteritidis repeat element,SERE-PCR)。ERIC序列,即腸桿菌基因間保守重復序列,長度為126bp,在不同細菌中的分布位置及拷貝數不同[11],經凝膠電泳產生特異圖譜;很多微生物基因組DNA中包含貫穿整個基因組的高度重復短DNA序列,一般1～10bp,這些短串重復序列可區分到種或者菌株的水平?；谶@些序列進行PCR擴增的方法就叫REP-PCR[12]。BOX片段是另一個原核生物基因組重復序列,大小為154bp,由boxA(57bp)、boxB(43bp)和boxC(50bp)3種不同的亞單位組成,其中只有boxA存在菌屬、種、株水平的分布差異及表現出多拷貝和高保守性[13]。SERE與ERIC相似,為腸炎沙門氏菌重復序列,并廣泛存在于細菌及古菌基因組中[14]。

RAPD技術操作簡便,無須專門設計引物,沒有種屬限制,無須知道樣本序列信息。為確保退火時雙鏈的穩定性,引物G+C含量應>40%。雖然RAPD技術本身耗時短成本低,但在分析前,往往需要篩選大量的引物[15]。對實驗條件敏感,重復性和穩定性差?？赏ㄟ^優化反應條件或結合序列特征化擴增區域標記技術(Sequence Characterized Amplified Region,SCAR)來克服此缺點[16-17]。ERIC技術與普通RAPD技術相比,引物長度長,退火溫度高于52℃,因此圖譜穩定,重復性高。有學者采用傳統RFLP、RAPD及核糖體分型(Ribotyping)技術,比較腦膿腫患者及其牙周袋中星座鏈球菌的遺傳多態性,傳統RFLP分辨率最差且產生條帶多不便于后續分析,另外兩種技術結果相似[18-19]。采用RAPD及RiboPrinter核糖體分型系統對乳桿菌屬內種間鑒定時,認為RAPD的敏感性較高,但實驗步驟較復雜耗時較長。有學者用BOX-、ERIC-和REP-PCR對同一樣本分別進行指紋分析,三者結果相似度很高,但想得到更精細的系統進化樹,可將三者聯合應用[20]。還有學者首次采用ERIC技術對具核梭桿菌種內株間鑒定,并與AP技術相對比,發現兩者的分辨率均較高[21]。除此以外,利用分子標記技術對凝固酶陰性葡萄球菌菌種鑒定,并將tDNA-PCR及ERIC-PCR兩種分子生物學方法的鑒定結果與傳統的Auto Scan-4微生物分析儀和API Staph鑒定系統進行比較,一致率為95%[22]。用ERIC-、REP-、SERE-及BOX-PCR對草綠色鏈球菌進行屬內種間及種內株間鑒別時發現,前三者所得結果非常相似,而BOX-PCR不能檢測出口腔鏈球菌,因此沒有進行進一步的比較。同時認為,BOX-PCR適合于革蘭氏陰性細菌的種水平鑒定,前三者適用于革蘭氏陽及陰性細菌的株水平鑒定, 但不適用于種水平鑒定[23]。

6 擴增片段長度多態性標記技術

擴增片段長度多態性標記技術(Amplified fragment length polymorphism,AFLP)為限制性酶切片段的選擇擴增來顯示片段多態性的方法。具體步驟為基因組DNA經限制性內切酶雙酶切后,形成分子量大小不等的限制性片段,再將雙鏈人工接頭(Artificial adapter)連接在黏性末端,形成一個帶接頭的特異片段,并作為PCR的模板,擴增片段電泳形成特異性圖譜[24]。

AFLP綜合了PCR及RFLP的優點,無須預知樣本基因組信息。DNA用量少,可靠性好,分辨率高,重復性高。但該技術費用昂貴,過程復雜,對技術操作人員的技術水平要求較高,擴增時可能產生假陰性及假陽性結果。AFLP的核心問題在于限制性內切酶的選擇,研究發現EcoRI-MseI 和 ApaI-TaqI 非常適合于G+C含量較低和較高的菌種。對含量在40～50mol %的菌種,可用HindⅢ-TaqI組合。AFLP在區分緣菌株方面也非常具有潛力。有學者選用黃單胞菌屬180株菌株,對AFLP、rep-PCR(BOX、ERIC、REP)及DNA-DNA雜交三種細菌分類方法比較,結果表明三者有較好的一致性[20]。

7 定量逆轉錄PCR

定量逆轉錄PCR(Reverse transcriptase PCR,RT-PCR)包括兩個基本過程:mRNA的反轉錄和定量PCR。定量PCR的基本原理是在PCR擴增的指數期,產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系。因此可根據PCR擴增產物的量確定目標基因的表達水平。根據定量測定的時間,定量RT-PCR可分為實時定量RT-PCR(Real time quantitative,real-time RT-PCR)和終點定量RT-PCR(End point measure quantitative,RT-PCR)。real-time RT-PCR具有全封閉、自動化、不需凝膠電泳、重復性好及精確定量等優勢,在口腔微生物領域被廣泛應用。但PCR前核酸的提取效率,反應過程中任一因素的細微變化均可導致最終結果的巨大差異[25]

8 熒光原位雜交技術

熒光原位雜交技術(Fluorescence in situ hybridization,FISH)基本原理是用熒光材料將一種核酸單鏈標記成探針,在微生物核酸的原有位置進行雜交。采用激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)和落射熒光顯微鏡(EFM)獲得微生物在形態學、數量及空間分布等方面的信息,對樣品進行定性定量分析[26]。

FISH技術操作簡便,實驗成本相對較低。但探針接近靶區的能力,探針的敏感性、特異性和穩定性等問題還需要進一步改善。除此以外,有學者將掃描電鏡(SEM)、傳遞電子顯微鏡(TEM)與FISH-CLSM聯合應用,更好地顯示出菌體—細胞外基質—菌體所處環境三者本身的結構及相互的空間結構關系[27-28]。微觀放射自顯影集成技術(Microautoradiography fluorescence in situ hybridization,MAR-FISH)還能反映出不同微生物的生物代謝情況;酪胺信號放大熒光原位雜交技術(Tyramide signal amplification fluorescence in situ hybridization,TSA-FISH)可以顯著增強信號強度提高靈敏度,并縮短探針長度[29]。TSA還可與基因芯片技術合用,起到與TSA-FISH相似的信號增強作用。

9 抑制消減雜交技術

抑制消減雜交技術(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)是一種比較不同群體中差異表達基因的技術。首先將待測樣本cDNA(如高毒力菌株)和驅逐樣本cDNA(如低毒力菌株)分別用同一種限制性內切酶消化,再將兩者變性后經過兩次雜交復性,使差異表達的序列片段得到富集。通過第一輪具有抑制作用的PCR擴增,使共同表達序列得到抑制,差異表達的序列片段得到顯著擴增,再經過第二輪巢式PCR,極大地提高了差異表達的目片段的特異性及豐度。

SSH技術可檢測低豐度表達基因,假陽性率低,高敏感性及一次反應可檢出幾十或成百差異表達的基因。但需要幾微克mRNA,同時兩樣本之間要有相似的遺傳背景[30]。

10 基因芯片技術

基因芯片技術(Gene chip)是將DNA探針列陣固定于固相基質上,將待測樣品的DNA/RNA片段用熒光或其他方法標記后作為靶分子,與基因芯片上的探針列陣雜交。由于列陣中特定位置上的核苷酸序列是已知的,所以對每一位點上的熒光強度進行檢測,即可對樣品的遺傳信息進行定性定量分析。雜交信號常用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測,并用專用軟件記錄分析后輸出結果。

該技術直接以序列差異作為標記,具有高通量、并行性及自動化等優點,特別在基因相互作用和調控關系的研究方面具有獨特優勢,被認為是應用前景最好的遺傳標記技術。但成本昂貴、影響雜交動力學的因素等還有待深入研究。目前有學者應用肽核酸(Peptide nucleic acid,PNA)代替DNA制作探針以解決雜交時芯片上的探針自身形成二級甚至是三級結構的問題。同時認為,PNA-DNA的結合比DNA-DNA的結合更加牢固[31]。還有學者將SSH技術與基因芯片相結合,彌補互相缺陷。SSH能夠有效篩查低豐度差異表達的基因,還能分離和鑒定未知基因,而這些是基因芯片無法完成的。差異表達基因若通過Northern blot來驗證,其工作繁重且效率低?；蛐酒夹g可以彌補這點不足。除此以外,口腔致病菌生物信息資源庫(The Bioinformatics Resource for Oral Pathogens,BROP),可向研究者提供芯片序列等相關信息。

綜上所述,口腔微生物在維持口腔健康方面發揮著重要作用。一系列新型分子生態學技術的引用,為基因層面上深入分析口腔微生物提供了從整個群落—屬—種—株—特定基因鑒定和表達及與宿主相互關系的研究方法,極大地促進了口腔微生物學的發展。這些方法不僅可對微生物進行定性定量分析,還可進行形態學觀察,甚至是微生物群落生態變化的功能性試驗,監控菌落生態系統的動態變化,了解微生物與宿主之間的相互關系。其中的許多試驗方法不僅特異性高,高通量,而且操作簡便,節省時間。但每種方法還存在各種問題,適用范圍也有所不同,需根據實驗目的選擇合適的實驗方法。