LAMP技術特點及其用于肝炎病毒檢測的相關研究進展

普彬，徐向紅

1甘肅省人民醫院中醫二科，蘭州 730000；2甘肅省臨床醫學轉化研究所，蘭州 730000

肝炎病毒為臨床常見肝臟感染病原菌，感染后會造成肝臟炎性損傷、肝臟纖維化，并誘發肝臟細胞癌變，威脅患者生命安全，需盡早檢出并積極抗病毒治療，以促進患者肝臟功能恢復[1]。目前在對肝炎病毒診斷中，常見方法包括血清抗原-抗體特異性檢測、聚合酶鏈式反應（PCR）等，并通過肝臟損傷相關血清指標輔助診斷，但存在診斷效能低、診斷操作用時長等不足。環介導等溫擴增技術（LAMP），指在等溫（60～65℃）下，短時間內完成核酸擴增，具有操作簡便、診斷用時短、診斷精確度高等優勢[2]。且隨該方法研究不斷深入，應用LAMP 技術中，通過應用微流控芯片技術、CRISPR-Cas 技術等，可實現LAMP 技術優化，進一步提升LAMP 技術診斷效能。

1 LAMP技術原理

LAMP 為一種全新的核酸擴增方法，通過設計引物、反應（合成模板、循環擴增、延伸、再循環）獲得不同莖長度莖環結構的DNA，及許多環結構的DNA 混合物。

1.1 設計引物 由4 條特異性引物識別靶基因序列兩側各3 段6 個不同核酸位點序列，應用一種具有鏈置換特性的DNA 聚合酶-Bst DNA 聚合酶，在等溫條件下進行靶序列擴增。4 條引物分別為FIP（包含與目的片段F2c 互補的F2，與F1 片段互補的F1c）、BIP（包含與目的片段B2c 互補的B2，與B1 片段互補的B1c）、F3、B3，其中后兩者為前兩者外側引物，與目的片段上F3c、B3c 互補。

1.2 擴增過程

1.2.1 合成模板 模板合成過程中，溫度維持在65℃左右，引物在雙鏈DNA 互補部位堿基配對中，會干擾雙鏈聚合過程，解離形成DNA 單鏈。鏈置換型DNA 聚合酶作用在引物FIP 的F2 區段末端位置為起點，與模板DNA 互補配對成雙鏈，同時引物中F3、F2c 前端與F3c 序列互補，鏈置換型DNA 聚合酶在末端位置作用，從頭端開始置換由FIP 引物合成的DNA 鏈，并把靶序列合完成DNA 雙鏈合成過程。FIP 合成的互補鏈中，F1 區、F1c 區，其堿基自我配對會形成DNA 單鏈環狀結構，內部引物BIP 與該鏈另一端雜交，外引物B3 結合到該鏈上，形成新的互補鏈，置換出BIP 合成互補鏈，而被置換出來的單鏈兩端堿基互補，自形成中間單鏈結構、兩端環狀結構的單鏈結構。該鏈經自身引導延伸作用形成雙鏈莖環結構（啞鈴狀），用于LAMP 技術循環擴增模板。

1.2.2 循環擴增 引物FIP 與循環起始莖環結構結合后，DNA 雙鏈中其中一條為延伸模板，另一條被釋放出來，其3 端自身成環，在鏈延伸取代作用下，將上一步FIP 引導合成的鏈結構釋放出來，作為循環起始物，引物BIP、FIP 與其上莖環結合后，重復上述延伸過程，產物延長過程中，釋放新鏈作為下以循環起始物，最終獲得長度不同的莖環狀雙鏈DNA產物。LAMP 循環擴增過程中，擴增、監測在指數增長期完成。

2 LAPM技術特點

LAMP 主要優勢為靈敏度、特異度高，檢出速度快、操作簡便、產物檢測方便。LAMP 循環擴增過程中，擴增、監測在指數增長期完成，可避免平臺期擴增監測影響診斷靈敏度。而在檢測中，靶基因6 個區域均被引物識別后進行擴增反應，因此診斷特異度高，若存在1 個核酸差異，LAMP 技術可通過區分相應靶序列擴增。而在LAMP 反應過程中，添加2 條環狀引物，可縮短反應時間，且環狀引物、莖環結構在F1 區域，或B2、B2 之間結合，從F1～F2 方向，或B1～B2 方向結合，莖環DNA 與內引物雜交，或與環狀引物雜交，以啟動鏈置換DNA 合成過程，加快反應速度，可在30～60 min 內完成檢測，可將產物擴增至109～1010 倍，應用PCR 技術獲得該結構，因此檢出速度快、檢測效率高。與其他擴增方法相比，LAMP 技術不需要復雜昂貴儀器設備，可在恒溫器中完成全部反應過程，適用于基層醫院推廣使用，成本較低。在大量合成核酸過程中，dNTP 中所析出的焦磷酸根離子與Mg 離子結合后，其形成產物出現肉眼可見沉淀，或在400 nm 光下利用濁度檢驗可完成結果檢出，產物檢測方便。

3 LAPM技術用于肝炎病毒檢測中的應用價值

3.1 肝炎病毒檢測現狀 甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒均為常見感染病毒，發生感染后會造成肝臟細胞損傷，隨炎性反應進展可能會引發肝組織癌變，威脅患者生命安全。盡早檢出肝炎病毒、盡早進行抗病毒治療對患者尤為關鍵。

目前在對肝炎病毒臨床診斷中，抗原-抗體特異性診斷，具有操作簡單、診斷費用低、診斷用時短等優勢[3]。但在患者感染早期，未發生抗原-抗體特異性反應，或患者既往感染史，會存在一定漏診率，且此種方法對肝炎病毒感染定量效果有限[4]。PCR 技術為分子生物學診斷方法，通過檢測肝炎病毒DNA 片段進行該病診斷，具有診斷靈敏度高的優勢，并可同步滿足肝炎病毒感染定量及定性檢驗。但PCR 技術操作難度大、診斷用時長且診斷費用高，在對肝炎病毒感染診斷中無法普及[5]。

血清肝功能指標，為肝臟損傷重要診斷評估方法，常見診斷指標包括谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）等，其血清指標水平上升提示患者出現肝臟損傷[6]。應用肝功能指標診斷中，主要作為是否出現肝臟損傷及肝臟損傷程度評估，但無法將指標作為肝炎病毒直接診斷指標，可將其作為輔助診斷指標。

3.2 LAPM 技術用于肝炎病毒檢測中的應用情況 LAMP 技術對肝炎病毒診斷中，對樣本量要求較低，診斷靈敏度高。李雪梅[7]在對甲型肝炎病毒檢測中，建立甲型肝炎病毒實時逆轉錄環介導等溫擴增（RT-LAMP）快速檢測方法，即選擇甲型肝炎病毒外殼編碼外殼蛋白VP1 的基因為特異靶基因，依據特異基因序列6 個獨立區域，在引物設計網站進行引物參數設置，獲得實時RT-LAMP 反應所需的 6 條引物，反應體系中，25 μl 反應混合物中包含1 μl RNA 模板，1.4 mmol/L dMTP、20 mmol/L Tris-HCL、10 mmol/L（NH4）2SO4、10 mmol/L KCL、0.1% Triton X-100、40 pmol/L FIP 及BIP、0.8 mol/L 甜菜堿、8 mmol/L MgSO4/5 pmol/L F3 及B3、8U Bst DNA 聚合酶及逆轉錄酶、20 pmol/L LB；所有混合物65℃恒溫反應60 min，陰性對照為雙蒸水。結果檢測中，其產物與反應液中二價鎂離子會形成焦磷酸鎂（白色沉淀），應用實施濁度儀LA-500 測定結果，繪制曲線判斷檢測結果，分析最佳實時RT-LAMP 反應溫度及診斷特異性，結果顯示，最佳檢測溫度為63℃，最小檢測限為10 拷貝/μl，且僅對甲型肝炎病毒靶基因特異。

在對乙肝病毒臨床診斷中，LAMP 技術應用頻率較高。周航宇[8]在一項mate 分析中，在PubMed、Cochrane 臨床試驗數據庫、EMBASE、CNKI 等進行文獻搜索，共計納入12 篇參考文獻，利用Stata 12.0軟件進行發表偏倚檢測，結果顯示，12 篇參考文獻中共計1494 份樣本，應用隨機效應模型計算合并效應量，結果顯示，LAMP 對乙型病毒感染診斷合并靈敏度為0.922，合并特異度為0.860，合并陰性似然比為0.093，合并陽性四完畢為15.400，診斷優勢比（DOR）為311.090，綜合受試者工作特征（SROC）曲線下面積為0.986，Q 指數為0.949，s 漏斗圖檢驗結果提示無明顯發表偏倚，提示在對乙型肝炎病毒診斷中，LAMP 對其綜合診斷能力較高。

丙型肝炎病毒臨床診斷中，多以RT-PCR 方法診斷，但其診斷特異性較低。近年來在對丙型肝炎診斷中，LAMP 技術應用頻率逐漸提升。楊川琪[9]在對丙型肝炎病毒診斷中，針對丙型肝炎病毒HCV-1b、2a、3、6a 基因型設計其亞型引物，設計一對通用引物擴增HCV-1b、3a、3b，另外設計一對通用引物擴增HCV-2a、6a，并在兩個體系中分別設計亞型探針，依據HCV 全基因5'UTR～Core 區中各基因型特異基因序列，軟件設計對應引物后，優化LAMP 反應體系，并設計HCV-1/3、2/6 引物用于解螺旋酶恒溫擴增（HDA），對每個體系設計相應基因探針進行基因分型，并與熒光定量PCR 檢測結果對比，結果顯示，LAMP技術對HCV-1b、3、6a 型最低檢測限為1.5×103IU/ml，HCV-2b 最低檢測限為1.0×103IU/ml，與PCR 法相比，兩種方法陽性檢出率相近，但LAMP 技術結果檢出時間為60 min 左右，較PCR 技術的90 min 短。

4 LAPM技術不足及優化措施

4.1 LAPM 技術不足 LAMP 技術為多種酶復合反應體系，酶處于非最佳反應溫度范圍內時，酶反應能力下降，甚至會發生相反效果，如限制性內切酶活力下降，可能會出現聚合酶堿基錯配延伸概率升高、發生非特異性切割等情況。而在反應過程中，若未發生溫度變化，可能會影響DNA 雙鏈結構未能完全打開，或重復序列出現發夾結構變化，或引物與互補片段錯配，或在反應體系中發生引物之間非特異性互補，出現假陽性情況。若患者樣本來源復雜，樣本中可能存在擴增反應抑制物，影響反應靈敏度。

4.2 LAPM 技術優化措施 恒溫條件可能會出現單鏈DNA 形成局部二級結構。甜菜堿為一種生物堿，化學結構與氨基酸相似，在反應體系中加入甜菜堿，可幫助DNA 聚合酶順利通過DNA 二級結構，避免在聚合過程中DNA 聚合酶從模板中分離。單鏈結合蛋白（SSBs）與單鏈DNA 非特異性結合后，可避免DNA 單鏈形成二級結構，同時可避免DNA 單鏈被核酸酶降解。CRISPR 為原核生物基因組內一段重復序列，而在CRISPR-SDA 恒溫擴增過程中，若缺少SSB 蛋白，則引物3'末端難以與dsDNA 結合，因此會影響擴增實驗結果；而在反應過程中增加SSB 蛋白，會增加反應速率，并減少背景信號干擾，提升診斷效果。

細胞高度擁擠狀態，酶促反應速率相應提升，而在反應體系中增加多聚糖、聚乙二醇，可提升聚合酶活性，將樣本非折疊狀態改變為折疊狀態，以增強酶穩定性。

在反應過程中，需嚴格控制樣本質量，避免樣本中蛋白酶、血紅素等物質影響酶結構及酶活性。血清白蛋白（BSA）中賴氨酸含量較高，其結構中疏水鍵可相互作用，降低酚類化合物對蛋白酶功能影響。海藻糖具有脫水、干燥、抗氧化等作用，在反應體系中添加海藻糖，可減少樣本中不良因素對酶穩定性影響，即在應用海藻糖過程中，可與蛋白酶表面殘余水分子結合后，提升蛋白酶構象穩定性。在此基礎上，將LAMP 技術與其他方法聯合應用，包括熒光定量LAMP、膜吸附法結合可視化LAMP 等，可進一步提升診斷效能。

5 小結

肝炎病毒為臨床常見診斷內容，應用LAMP 技術可滿足肝炎病毒診斷需求，且具有診斷速度快、診斷效能高等優勢，設計不同基因型探針，可滿足病毒不同基因型診斷檢出結果。隨近年來LAMP 技術進展及優化，可減少細胞折疊、樣本雜質等因素對診斷結果影響，可進一步提升LAMP 技術診斷效能。