基于NF-κB信號通路探討長鏈非編碼RNA NORAD對IL-1β誘導骨關節炎軟骨細胞炎癥損傷的作用

陳永鋒 宋和強 王鵬 郭建偉 陳曉超

骨關節炎是關節部位的退行性炎癥病變,常發于膝、胯、手和脊柱等部位關節,其主要病理特征為軟骨組織的退變和炎性反應[1]。據統計,>65歲的老齡群體中高達1/2的人患有骨關節炎[2]。骨關節炎不僅帶來生理上的疼痛,而且會導致行動困難,甚至殘疾,嚴重影響患者的生活質量,給患者家庭造成嚴重的負擔[3]。骨關節炎的發病由多種因素引起,但其發病的分子調控機制還沒有得到完全的闡明[4]。軟骨細胞是關節軟骨的主要組成細胞,其通過調控細胞胞外基質和基質降解酶的合成和分泌,維持關節組織的穩態[5]。在炎性因子的刺激下,軟骨細胞的新陳代謝過程被擾亂,導致細胞外基質過度降解和凋亡,是關節炎發病的重要病理變化[6]。因此,探尋骨關節軟骨細胞炎癥損傷過程中的關鍵調控基因,對于研發關節炎的有效治療方法具有重要意義。長鏈非編碼 RNA(long noncoding RNAs,lncRNA)是長度>200個核苷酸的非編碼RNA,具有調控染色質重構、基因轉錄和蛋白翻譯等多種功能,在細胞增殖、周期、凋亡和分化等細胞生物學過程中發揮重要作用[7]。研究表明LncRNA參與調控多種疾病的發生和進展過程,是當前研究的一個熱點領域[8]。已有研究發現多種lncRNA在骨關節炎中異常表達,特別是對軟骨細胞的炎癥損傷具有重要的調控功能[9]。DNA 損傷激活的非編碼 RNA(non-coding RNA-activated by DNA damage,NORAD)是目前研究比較廣泛的一個新型lncRNA,在哺乳動物中高度保守,對基因組的穩定性具有重要的調控作用,已在多種疾病中報道了其重要功能[10-12]。值得注意的是NORAD在炎癥相關的疾病中異常表達,對炎性反應和炎癥引起的細胞損傷具有重要的調控作用[13-15]。本研究通過IL-1β刺激軟骨細胞建立骨關節炎的細胞模型,研究NORAD對軟骨細胞炎癥損傷的調控功能,并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人關節軟骨細胞和軟骨細胞完全培養基購自武漢普諾賽生命科技有限公司;重組人IL-1β蛋白購自北京索萊寶科技有限公司;總RNA提取試劑TransZol、蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購和ECL發光試劑自北京全式金生物技術股份有限公司;逆轉錄試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit和實時定量熒光PCR試劑盒TB Green Fast qPCR Mix購自大連寶生物工程有限公司;Calcein AM細胞活性檢測試劑盒和一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天科技有限公司;人IL-6和TNF-α的 ELISA檢測試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;兔抗人Bax、Bcl-2、MMP-13、COL2A1和GAPDH一抗和HRP標記的山羊抗兔二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司;兔抗人NF-κB p65和phospho-NF-κB p65一抗購自上海賽信通生物試劑有限公司;PCR擴增引物由上海生工生物工程股份有限公司合成;NORAD siRNA和對照NC siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。

1.2 細胞培養 取出T25細胞培養瓶,用75%乙醇消毒瓶身,放入37℃、5% CO2的細胞培養箱中靜置3～4 h。吸除培養基,PBS清洗細胞。加入0.25%胰蛋白酶消化液,輕微轉動培養瓶至消化液覆蓋整個培養瓶底,37℃溫浴2 min。倒置顯微鏡下觀察,當細胞回縮變圓后,加入完全培養基終止消化。用移液槍吹打瓶壁,使細胞脫落,按1∶3的比例將細胞懸液轉移到新的培養瓶中,補充新鮮完全培養基,置于37℃、5% CO2的細胞培養箱中培養,每3天更換1次培養液。

1.3 細胞轉染 將軟骨細胞按3×104的密度接種于24孔細胞培養板,過夜培養,待細胞完全貼壁后,細胞密度達到50%～60%,進行siRNA轉染。將20 pmol待轉染的siRNA與100 μL無血清和無抗生素的OPTI-MEM培養基混勻,隨后加入2 μL siRNA-mate 轉染試劑,快速渦旋 10 s,使其完全混勻。室溫靜置 10 min,使siRNA和轉染試劑形成轉染復合物。轉染前,更換新鮮培養液,將轉染復合物加入到細胞培養孔中,輕搖混勻,置于37℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。培養48 h后,收集樣品,驗證NORAD的表達水平變化?；虺晒η玫秃?進行后續實驗。NORAD siRNA(si-NORAD)靶向序列為:5’-GCCACCUUUGUGAACAGUAUA-3’;對照siRNA(si-NC)靶向序列為:5’-UUCUCCGAACGUGUCU-3’。

1.4 骨關節炎細胞模型建立和分組 參考文獻[16]報道方法,建立骨關節炎細胞模型。將重組人IL-1β蛋白加入到軟骨細胞培養孔中,使其終濃度達到10 ng/mL,然后繼續培養24 h。將軟骨細胞分為4組:對照組(不進行任何處理,正常培養)、IL-1β組(采用10 ng/mL的IL-1β刺激軟骨細胞24 h)、IL-1β + si-NC組(轉染NC siRNA 48 h后,進行IL-1β刺激)和IL-1β + si-NORAD組(轉染NORAD siRNA 48 h后,進行IL-1β刺激)。

1.5 RT-qPCR檢測NORAD表達 4組細胞處理完成,倒出培養液,PBS清洗細胞,加入TransZol,放置片刻,使細胞充分裂解。用移液槍吹打細胞,將細胞裂解液轉移到離心管,加入RNA Extraction Agent,劇烈震蕩15 s,室溫孵育3 min。低溫(2～8℃)10 000 × g離心15 min,將水相轉移到新的離心管,采用異丙醇-乙醇抽提法進一步提取RNA。將抽提的RNA溶解于RNA溶解液中,以備后續使用。配置10 μL逆轉錄反應體系:2 μL PrimeScript Buffer,0.5 μL PrimeScript RT Enzyme Mix,0.5 μL Oligo dT Primer,0.5 μL Oligo dT Primer,0.5 μL Random 6 mers,500 ng總RNA,加 DEPC處理的水補至10 μL。設置以下逆轉錄程序:37℃逆轉錄反應5 min,85℃逆轉錄酶失活反應5 s。配置20 μL PCR反應體系:10 μL TB Green Fast qPCR Mix,1 μL前引物,1 μL后引物,2 μL DNA模板,加滅菌水補至20 μL。設置PCR擴增程序:95℃預變性30 s;95℃變性5 s,60℃延伸30 s,40個循環。以GAPDH為內參對照,采用2-ΔΔCt法計算NORAD相對表達水平。擴增引物序列如下:NORAD前引物為5’-TGAAGGCAGAGAAGGAAGGG-3’,后引物為5’-TCCACCACATACACAGCACT-3’;GAPDH前引物為5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’,后引物為5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.6 Calcein AM細胞活性實驗檢測軟骨細胞存活率 將軟骨細胞接種于全黑96孔細胞培養板(5 × 103),過夜培養。根據1.3分組處理后,吸除培養液,PBS洗滌細胞。每孔加入100 μL Calcein AM檢測工作液,37℃避光孵育30 min。孵育結束后,將細胞培養板置于熒光酶標儀(激發波長494 nm,發射波長517 nm)檢測熒光強度,并計算細胞存活率。

1.7 TUNEL實驗檢測軟骨細胞凋亡 將軟骨細胞按1.3分組處理后,去除培養液,PBS洗滌細胞。加入免疫染色固定液,室溫固定細胞30 min。PBS洗滌細胞,加入免疫染色強力通透液,室溫孵育5 min。將TdT酶和熒光標記液混合,配置成TUNEL檢測液。PBS清洗細胞,加入TUNEL檢測液,37℃避光孵育60 min。PBS清洗細胞,加入DAPI溶液對細胞核進行復染。PBS清洗細胞,用抗熒光淬滅封片液封片后,置于熒光顯微鏡下觀察。隨機選取3個固定大小的視野,對TUNEL染色細胞(綠色)和總細胞(藍色)計數,以此計算凋亡細胞比例。

1.8 Western blot實驗檢測Bax、Bcl-2、MMP-13、COL2A1和NF-κB p65蛋白的表達 按1.3處理細胞完成后,去除培養液,PBS洗滌細胞,加入裂解液,劇烈震蕩15 s,冰上孵育30 min。低溫(2～8℃)14 000×g離心10 min,收集上清液,采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白提取樣品和SDS上樣緩沖液混合,煮沸5 min,進行變性處理。將處理后的蛋白樣品,每孔等量地加入到配置好的SDS-PAGE膠,進行電泳分離。電泳結束后,將膠、濾紙和PVDF膜制成三明治結構,進行轉模實驗。轉模完成后,將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中,室溫下密封1 h。用封閉液稀釋第一抗體,與PVDF膜一起孵育,4℃搖床中培養過夜。TBST洗膜,將膜與稀釋的HRP標記的二抗孵育,室溫1 h。TBST洗膜,將ECL發光液均勻涂抹于膜上,采用凝膠成像儀進行曝光和圖像采集。

1.9 ELISA檢測IL-6和TNF-α的濃度 根據1.3處理細胞完成后,500 × g離心5 min收集上清。將上清液按加入到ELISA板中(100 μL/孔),用封板膜封住反應孔,室溫孵育120 min,洗板5次,用厚吸水紙拍干。加入加入生物素化抗體溶液(100 μL/孔),室溫孵育60 min,洗板5次,用厚吸水紙拍干。加入辣根過氧化物酶標記Streptavidin(100 μL/孔),室溫孵育20 min,洗板5次,用厚吸水紙拍干。加入顯色劑TMB溶液(100 μL/孔),室溫孵育20 min。加入終止液(50 μL/孔),混勻后立即用酶標儀測量450 nm處的吸光度,計算相應炎性因子濃度。

2 結果

2.1 敲低NORAD對IL-1β刺激的軟骨細胞存活率的影響 與對照組比較,IL-1β組軟骨細胞中NORAD的表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.01)。與IL-1β + si-NC組比較,IL-1β + si-NORAD組軟骨細胞中NORAD的表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.01)。與對照組比較,IL-1β組和IL-1β + si-NC組軟骨細胞存活率降低,差異有統計學意義(P<0.01)。與IL-1β組和IL-1β + si-NC組比較,IL-1β + si-NORAD組軟骨細胞存活率提高,差異有統計學意義(P<0.01)。見表1、2。

表1 轉染si-NORAD對軟骨細胞中NORAD表達水平的影響

表2 敲低NORAD對IL-1β刺激的軟骨細胞存活率的影響 %,

2.2 敲低NORAD對IL-1β刺激軟骨細胞凋亡的影響 與對照組比較,IL-1β組和IL-1β + si-NC組軟骨細胞凋亡比例增加,(P<0.01)。與IL-1β組和IL-1β + si-NC組比較,IL-1β + si-NORAD組軟骨細胞凋亡比例下降(P<0.01)。與對照組比較,IL-1β組和IL-1β + si-NC組促凋亡蛋白Bax表達水平上升(P<0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平下降(P<0.01)。與IL-1β組和IL-1β + si-NC組比較,IL-1β + si-NORAD組Bax蛋白表達水平下降(P<0.01),Bcl-2蛋白表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1、2,表3、4。

圖1 敲低NORAD對IL-1β刺激的軟骨細胞凋亡的影響(TUNEL×200)

圖2 敲低NORAD對IL-1β刺激的軟骨細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達水平的影響

表3 敲低NORAD對IL-1β刺激的軟骨細胞凋亡率的影響 %,

表4 Bax和Bcl-2蛋白表達相對定量分析

2.3 敲低NORAD對IL-1β刺激的軟骨細胞外基質降解的影響 與對照組比較,IL-1β組和IL-1β + si-NC組基質金屬蛋白酶MMP-13表達水平升高,二型膠原蛋白COL2A1表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.01)。與IL-1β組和IL-1β + si-NC組比較,IL-1β + si-NORAD組MMP-13表達水平降低,COL2A1表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3,表5。

圖3 敲低NORAD對IL-1β刺激的軟骨細胞中MMP-13和COL2A1蛋白表達水平的影響

表5 MMP-13和COL2A1蛋白表達相對定量分析

2.4 敲低NORAD對IL-1β刺激的軟骨細胞炎性因子分泌的影響 與對照組比較,IL-1β組和IL-1β + si-NC組軟骨細胞上清液中IL-6和TNF-α的濃度增加,差異有統計學意義(P<0.01)。與IL-1β組和IL-1β + si-NC組比較,IL-1β + si-NORAD組軟骨細胞上清液中IL-6和TNF-α的濃度降低,差異有統計學意義(P<0.01)。見表6。

表6 敲低NORAD對IL-1β刺激的軟骨細胞中IL-6和TNF-α分泌水平的影響 pg/mL,

2.5 敲低NORAD對IL-1β刺激的軟骨細胞中NF-κB激活的影響 與對照組比較,IL-1β組和IL-1β + si-NC組NF-κB p65蛋白的磷酸化水平升高,差異有統計學意義(P<0.01)。與IL-1β組和IL-1β + si-NC組比較,IL-1β + si-NORAD組NF-κB p65蛋白的磷酸化水平降低,差異有統計學意義(P<0.01)。見圖4,表7。

圖4 敲低NORAD對IL-1β刺激的軟骨細胞中NF-κB p65蛋白磷酸化的影響

表7 NF-κB p65總蛋白和磷酸化蛋白水平定量分析

3 討論

LncRNA在骨關節炎中的作用是目前研究的一個熱點方向,有望為闡明骨關節炎的發病機制和研發新型治療方法,提供新的突破口[17]。IL-1β是一個可由多種細胞分泌的細胞因子,是骨關節炎進展過程中重要的促炎因子,采用IL-1β刺激軟骨細胞建立骨關節炎細胞模型,是目前體外模擬骨關節炎廣泛使用的模型[18-20]。本研究在IL-1β刺激軟骨細胞中發現lncRNA NORAD表達水平升高,并且敲低NORAD可以有效減輕IL-1β對軟骨細胞的炎癥損傷。本研究表明NORAD可能通過調控軟骨細胞的炎癥損傷在骨關節炎中發揮重要作用。

研究表明NORAD在多種炎癥相關疾病中異常表達。NORAD在肺結核患者的血清中顯著升高,并且與促炎因子IL-1β,TNF-α和IL-6濃度呈正相關性[13]。在潰瘍性結腸炎患者來源的結腸黏膜組織中,NORAD表達水平顯著上升[14]。另外,在新生兒敗血癥患者血清中NORAD表達水平升高,并且與IL-8,TNF-α和IL-6濃度呈正相關性[21]。目前,關于NORAD是否在骨關節炎中異常表達,筆者所見尚未有報道。本研究發現,NORAD在IL-1β刺激軟骨細胞建立的骨關節炎細胞模型中表達水平顯著升高。這一結果表明NORAD在骨關節炎中可能高表達,但其具體表達水平需要通過檢測臨床組織來進一步地確定。

NORAD對炎性反應和炎癥引起的細胞損傷具有重要的調控作用。在LPS刺激的局巨噬細胞中,敲低NORAD可以降低炎性因子IL-8、TNF-α和IL-6的分泌水平[21]。在肺微血管內皮細胞中,敲低NORAD可以減輕LPS誘導的細胞損傷[22]。在腎小管上皮細胞中,敲低NORAD可以減輕LPS誘導的細胞凋亡和炎性反應[23]。抑制NORAD還可以緩解結核桿菌感染對巨噬細胞的損傷作用,并且抑制炎性反應過程[13]。對糖尿病性心肌病小鼠靜脈注射NORAD的shRNA可以減輕心肌部位的炎性反應[15]。這些研究表明,抑制NORAD具有抗炎和細胞保護作用。本研究檢測了敲低NORAD是否對IL-1β刺激引起的效應具有調控作用。結果發現,通過轉染si-NORAD可以顯著降低IL-1β刺激的軟骨細胞中NORAD的表達水平。敲低NORAD可以提高IL-1β刺激的軟骨細胞的存活率,抑制細胞凋亡,阻斷細胞外基質的降解,并且降低炎性因子TNF-α和IL-6的濃度。這些結果表明,敲低NORAD可以減輕軟骨細胞受到的炎癥損傷。

轉錄因子NF-κB是炎性反應的重要調控因子,在骨關節炎的發生和進展中發揮關鍵的作用[24]。在IL-1β刺激的軟骨細胞中,NF-κB激活下游炎性因子表達,從而導致軟骨細胞損傷。本研究發現,IL-1β刺激軟骨細胞增加NF-κB p65蛋白的磷酸化水平,表明NF-κB被激活。值得注意的是敲低NORAD顯著降低NF-κB p65蛋白的磷酸化水平,表明NORAD對NF-κB信號通路具有重要的調控作用,但其具體調控機制,還不明確。NORAD主要通過海綿吸附體的作用吸附微小RNA來調控基因的表達。已有研究表明,NORAD可以作為miR-552-3p的海綿吸附體調控MyD88的表達,從而影響NF-κB的激活[14]。而關于NORAD在IL-1β刺激的軟骨細胞中lncRNA-miRNA-mRNA調控軸有待進一步研究。

綜上所述,敲低NORAD可以減輕IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥損傷,其保護作用可能是通過下調NF-κB信號通路抑制細胞凋亡,細胞外基質降解和炎性反應來實現的。