調節性 T 細胞在結直腸癌免疫治療中的意義

黨利敏 馬虎林

結直腸癌目前在全球癌癥發病率中排名第三,在癌癥相關死亡中排名第二,2020年全球結直腸癌新發病例1 931 590例,死亡935 173例,分別占癌癥發病和死亡總數的10.0%和9.4%[1]。化療聯合或不聯合靶向治療是轉移性結直腸癌(mCRC)的基本治療方法。由于化療藥物的不良反應和腫瘤細胞的生物學特性,傳統策略難以突破。了解腫瘤微環境(TME)中癌細胞和免疫細胞之間的相互作用是癌癥免疫治療的關鍵所在。癌癥發展過程中癌細胞與免疫系統之間的相互作用被概括為“癌癥免疫編輯”假說,由免疫消除、免疫平衡和免疫逃逸三階段組成[2]。免疫抑制機制為腫瘤細胞早期的無序性生長提供了先決條件,而調節性T細胞(Treg)在此機制中發揮著不可替代的作用。雖然 Treg 細胞對于維持免疫穩態至關重要,但它們在抑制癌癥免疫中的抗腫瘤免疫反應方面也起著核心作用。因此可通過耗竭Treg細胞來增加癌癥免疫療法的效果[3]。盡管已經對 Treg 細胞靶向治療的療效進行了臨床前試驗及臨床實驗,但 Treg 細胞耗竭引起的自身免疫性疾病仍然不容忽視[4-5]。Treg 細胞耗竭不僅會導致腫瘤浸潤部位 Treg 細胞的丟失,還會導致外周 Treg 細胞的丟失,這可能會損害對自身抗原的免疫耐受性,從而導致自身免疫性疾病的發生。因此,最佳的 Treg 細胞靶向免疫療法應選擇性地從 TME 中去除 Treg 細胞,同時保留外周 Treg 細胞,以預防自身免疫性疾病。隨著免疫檢查點阻斷(ICB)治療研究的深入,結直腸癌免疫耐藥機制逐漸明朗,新的預測性生物標志物不斷涌現。目前正在積極開展檢查免疫檢查點效果的臨床試驗,以期對 mCRC 患者產生持久效果。基因改變,例如癌細胞中的驅動基因改變,通過影響細胞因子/趨化因子環境和代謝微環境來募集和激活免疫抑制細胞,從而調節 TME 中的免疫反應[3]。因此,闡明癌細胞中的基因改變與癌癥患者個體的免疫反應之間的關系可能有助于“免疫精準醫學”的發展,“免疫精準醫學”目前在分子靶向治療領域不斷發展,并可擴展至癌癥免疫治療。本文通過總結Treg細胞的功能和表型,探討基于Treg細胞靶向治療結直腸癌的“免疫精準醫療”的發展。

1 TME中的 Treg 細胞

1.1 Treg 細胞的特征 Treg 細胞最初被認定為 CD4+T 細胞中的胸腺來源的免疫抑制細胞,在小鼠中具有高表達的 CD25 [白細胞介素 (IL)-2 受體 α 鏈][5],后來在人類中得以發現。叉頭轉錄因子(Foxp3)是叉頭轉錄因子的一個亞家族成員,是Treg細胞最關鍵的細胞內標志物,也是Treg 細胞的主要調節因子[6-7]。目前,Treg細胞根據其發育部位分為天然調節性T細胞和外周誘導的調節性T細胞[8-10]。研究發現,相比正常結腸組織,腫瘤浸潤組織中Treg細胞明顯增多,且與腫瘤的TNM分期呈正相關,同時腫瘤組織CD4+T細胞中Foxp3、IL-10、TGF-β1的mRNA表達水平明顯升高[11],然而,外周誘導的 Treg 細胞的體內功能和穩定性尚不清楚,尤其是在人類中。此外,人類 CD4+Foxp3+T 細胞在功能和表型上存在異質性,因為常規 CD4+T細胞在 TCR 刺激后瞬時表達 Foxp3[12-13],盡管Treg 細胞可被鑒定為表達 Foxp3 的 CD4+小鼠中的 T 細胞。因此,有必要將人類的 Treg 細胞與表達 Foxp3 的常規 T 細胞區分開來。根據 CD4、CD45RA、CD25 和(或)Foxp3的表達,人類表達 Foxp3 的 CD4+T 細胞可分為幼稚/靜息 Treg 細胞、效應/活化 Treg (eTreg) 細胞以及非Treg細胞。Foxp3+T 細胞很容易通過 TCR 刺激從常規 T 細胞中誘導出來,但這類細胞僅產生炎性細胞因子而不具備免疫抑制功能;然而,某些細胞因子或特定的微生物群會從 CD4+CD25-T 細胞誘導出具有免疫抑制功能的 Treg 細胞。相反,非 Treg 細胞不具備免疫抑制功能,而是產生炎性細胞因子,包括干擾素 (IFN)-γ 和 IL-17等[14-15]。

1.2 Treg 細胞的免疫抑制 Treg 細胞的免疫抑制功能通過多種機制介導,包括共刺激信號的下調[16],IL-2 的消耗,分泌免疫抑制細胞因子(例如 IL-10 和 IL-35)[17]以及免疫抑制代謝物的產生。CTLA-4 對于 Treg 細胞抑制至關重要,它可以避免異常的自身免疫反應并防止免疫反應的過度激活以保護宿主免受自身免疫攻擊[18]。樹突狀細胞(DC)與活化的eTreg細胞表達的CTLA-4結合,從而降低APC的CD80/86表達,阻礙APC的成熟、下調APC上CD80/86的表達[19]。IL-2 是效應 T 細胞(包括 CD8+T 細胞)激活和存活所必需的。高親和力 IL-2 受體由3個亞基組成:α 鏈、β鏈和γ鏈,分別對應CD25、CD122和CD132,大多數Treg 細胞表達高親和力CD25,因為 IL-2 受體信號對于 Treg 細胞功能維持及Foxp3 的誘導是不可或缺的[20]。Treg 細胞主要通過高親和力 IL-2 受體消耗 IL-2,幾乎不產生 IL-2,從而限制了TME中 IL-2 的數量。因此,效應T細胞由于缺乏對其激活至關重要的IL-2而變得功能失調。IL-10和IL-35通過下調APC上主要組織相容性復合體(MHC)和共刺激分子的表達抑制效應T細胞的功能和增殖[21]。Treg 細胞抑制抗腫瘤免疫反應,特別是腫瘤抗原特異性效應 T 細胞反應。Treg 細胞在某些化學因子的趨化下聚集于TME中,在局部增殖分化成一個激活的亞群,強烈抑制腫瘤抗原特異性效應 T 細胞的激活和擴增[22]。值得注意的是, TME 中的Treg 細胞比例的增高和效應 T 細胞(如 CD8+T 細胞)的增多與各種類型癌癥患者的不良預后相關(包括黑色素瘤、非小細胞癌、胃癌和卵巢癌)[10,23]。但在結直腸癌中,腫瘤浸潤性 Foxp3+T 細胞的預后價值仍存在爭議。然而,非 Treg 細胞的 Foxp3 低表達可能會誤導只針對Foxp3 表達的分析,因為人類 Foxp3+T 細胞同時包含 eTreg 細胞和非 Treg 細胞[3]。一些結直腸癌患者在 TME 中蓄積了較多 Foxp3+非 Treg 細胞,并伴有高水平的炎癥細胞因子,包括腫瘤壞死因子 (TNF)、轉化生長因子 (TGF)-β 和 IL-12,它們與良好的預后相關。與此同時,TME 中存在大量真正的 Treg 細胞,尤其是 eTreg 細胞,與不良預后相關,一些患者中幾乎檢測不到 Foxp3+非 Treg細胞,對上述其他類型癌的研究中也證實了這一點[24]。除此之外,一些報告觀點指出,顆粒酶依賴性靶細胞殺傷是 Treg細胞介導的免疫抑制的另一種機制,此機制通過顆粒酶和穿孔素的分泌,介導自然殺傷細胞和細胞毒性 T 淋巴細胞 (CTL)進行細胞溶解[25]。

Treg 細胞以抗原特異性方式在 TME 中擴增,并具有不同于一般 CD4+T 細胞的 T 細胞受體 (TCR) 庫[26]。此外,最近研究表明,TME 中存在大量高度活化的和具有分化表型的 Treg 細胞[27]。Treg細胞通過缺氧誘導因子1α(HIF-1α)的功能強烈抑制抗腫瘤免疫反應。在代謝方面,抗腫瘤免疫細胞CD8+T 細胞主要采用糖酵解途徑進行激活,癌細胞消耗葡萄糖可降低TME中的血糖水平(Warburg 效應),從而阻礙CD8+T 細胞激活進程[28]。同時,Treg 細胞在 TME 中處理豐富的乳酸[29]和脂肪酸[30]進行增殖并發揮其免疫抑制功能。在葡萄糖代謝升高的 TME 中,例如在肝轉移病灶,Treg 細胞被大量乳酸激活。因此,Treg 細胞獲得高 PD-1 表達,并被抗 PD-1 mAb 治療進一步激活,導致對 PD-1/PD-L1 阻斷療法產生耐藥性[31]。

1.3 Treg 細胞的激活/分化 TME 中 Treg 細胞的激活/分化已通過在單細胞水平上對分子表達進行多項綜合分析得到解決。ScRNAseq 分析表明,人類腫瘤浸潤性 Treg 細胞高度表達TNFRSF9,并且SOX4、HIVEP1和IRF4被確定為有助于表達 TNFRSF9 的 Treg 細胞發育的轉錄因子[32]。此外,與黑色素瘤患者的CD8+T細胞和傳統CD4+T細胞相比,Treg細胞中趨化因子受體8(CCR8)、TNFRSF1B、TNFRSF18和TNFRSF4的基因表達水平更高[33]。而高頻率表達IL10、IKZF3和LAG3的 CD38+Treg 細胞與結直腸癌患者的不良預后相關[34]。通過一系列單細胞基因表達和表觀基因組分析,已經證明轉錄因子 BATF 對于非小細胞肺癌 (NSCLC) 患者 TME 中 Treg 細胞的激活/分化至關重要[27]。其他轉錄因子(如 NR4A1 和 IRF4)對 Treg 細胞的激活和分化同樣重要,以上二者與BATF共同作用,在腫瘤浸潤的 eTreg 細胞中發揮“超級增強子”[35]的作用。

2 Treg 細胞與ICB

2.1 Treg 細胞靶向癌癥免疫療法 鑒于 Treg 細胞作為抗腫瘤免疫的免疫抑制劑的重要作用,各種 Treg 細胞靶向免疫療法已經在臨床前和臨床研究中進行了測試[36]。使用抗 CD25 抗體的 Treg 細胞靶向免疫療法的療效因癌癥類型的不同而有所差異。此外,改變抗CD25抗體的亞類可以進一步增強抗腫瘤作用。如使用鼠的IgG2a 和 κ 恒定區替換原始 αCD25 的恒定區,可以增強抗體依賴性細胞毒性 (ADCC) 活性,并有效消除小鼠中的腫瘤浸潤 Treg 細胞[37]。雖然 Treg 細胞耗竭或調節 Treg 細胞的免疫抑制是增強潛在抗腫瘤免疫力的有前途的策略,但 Treg 細胞靶向免疫療法可能并非對所有腫瘤都有效。對Treg細胞生存和生長至關重要的腫瘤需要通過生物標志物來定義。此外,全身性Treg細胞耗竭可能會增加免疫相關不良事件(irAE)的風險,如自身免疫[38]。為確保 Treg 細胞靶向免疫療法的安全性,應采用 TME 中的選擇性 eTreg 細胞耗竭而非全身性 Treg 細胞耗竭,以提高抗腫瘤功效而,避免誘導有害的 irAE。為此,目前已經使用全面的轉錄組和蛋白質表達測定,特別是在單細胞水平上,對TME中Treg細胞具有選擇性表達模式的一些分子進行了廣泛的檢測。例如,趨化因子受體4(CCR4)由eTreg細胞選擇性表達;因此,抗CCR4抗體可以通過單獨消耗eTreg細胞的同時保留幼稚的Treg細胞來激活腫瘤抗原特異性CD8+T細胞[39]。此外,其他分子(如 CCR8 和 GARP)已從腫瘤浸潤淋巴細胞的批量和單細胞 RNA 測序 (scRNAseq) 中被鑒定為腫瘤浸潤 Treg 細胞的特異性標記,從而為新型 Treg 細胞免疫療法靶向藥物的開發奠定基礎[40-41]。目前Treg被認為是實現放療成功的重大障礙,因此建議將基于Treg細胞的免疫療法與放療結合使用,以實現最大的治療效果。

2.2 Treg 細胞耗竭與ICB ICB治療可以通過針對腫瘤引起的免疫缺陷來激活腫瘤病灶的免疫反應并修復現有的免疫反應。該療法下的患者可能會獲得持久療效,但長期療效受限于治療過程中出現的耐藥機制。如在PD-1阻斷治療中,Treg細胞的生存和增殖功能依賴于TCR和CD28信號分子,故而PD-1阻斷可能激活Treg細胞的免疫抑制功能。同樣,PD-1 缺陷的 Treg 細胞具有很強的免疫抑制活性,以保護自身免疫表型[42],并且抑制 PD-1/PD-L1 信號傳導會導致早期 Treg 細胞動員的增加,從而抑制感染引起的急性炎癥。有研究表明,在一些進行抗 PD-1 mAb 治療的胃癌患者中,Treg 細胞介導的免疫抑制活性增強,從而導致 PD-1 阻斷治療期間病情的過度進展[43]。TME中的效應T細胞和Treg細胞表達PD-1的平衡與PD-1/PD-L1阻斷療法的療效密切相關,從而成為預測PD-1/PD療效的生物標志物。此外,抗 GITR 抗體、抗 4-1BB 抗體或抗 GARP 抗體與抗 PD-1 抗體聯合消除 Treg 細胞可增強抗腫瘤免疫反應的效果[44]。幾種影響Treg 細胞存活和功能的關鍵信號分子(如PI3K、c-Rel和LCK )抑制劑可增強抗腫瘤免疫反應[45]。例如,PI3K 抑制劑通過選擇性耗竭Treg 細胞來增加具備腫瘤抗原特異性記憶 CD8+T 細胞的數量[46]。另一份報告表明,CARMA1-BCL10-MALT1 (CBM) 信號體復合物的功能障礙可通過將 Treg 細胞功能從免疫抑制改變為免疫激活來改善 PD-1 阻斷的臨床效果[47]。總而言之,Treg 細胞靶向免疫療法不僅具有作為單一療法的潛力,而且還具有與 ICI (免疫檢查點抑制劑)聯合使用的潛力,包括 PD-1/PD-L1 阻斷療法。通過對腫瘤浸潤性Tregs進行的單細胞 RNA 測序,發現2個主要的腫瘤浸潤性Tregs亞群,其中CCR8與 Treg 激活標記物結合的獨特表達為高選擇性生物標記物的靶向治療提供了可能。使用新生成的抗CCR8納米抗體-Fc融合體選擇性耗竭 CCR8+調節性T細胞,可導致腫瘤生長顯著減緩,并表現出與抗PD-1療法協同的作用,從而提高抗腫瘤免疫的有效性和安全性[47]。同時也有研究顯示,CCR8+Treg的耗竭誘導了強效且更不易耗竭的CD4+和CD8+效應T細胞,上調CD80/CD86在抗原呈遞細胞(APC)上的表達,促進腫瘤抗原特異性效應/記憶CD8+T細胞的形成[48]。使用細胞消耗型抗 CCR8 單克隆抗體 (mAb) 選擇性地消除了多克隆腫瘤 Tregs,激發了抗腫瘤免疫反應,從而治愈了小鼠體內已形成的腫瘤,并且不會引發有害的自身免疫反應或免疫疾病。總之,研究證實 CCR8 是腫瘤組織中克隆性擴展 Tregs的標志物,抗 CCR8 mAb 治療在短期內選擇性消除此類多克隆 Tregs,可激發并維持較強的抗腫瘤免疫反應[49]。

2.3 TME中的T細胞抑制與ICB的耐藥 TME 中的幾種因素會共同作用抑制免疫功能,包括Treg、IL-10、腫瘤相關巨噬細胞 (TAM)、髓源性抑制細胞 (MDSC) 和相關細胞因子,這些因素均會影響 ICB 療效以及導致耐藥性的產生[50]。當 TME 中存在某些特定的非腫瘤細胞 (NTC) 時,盡管有足夠的 CD8+T 細胞浸潤和 IFN-γ 反應,但 ICB 仍會出現治療耐藥性。具有調節局部免疫功能能力的Tregs和MDSCs被認為是NTCs的代表。當 Treg 或 MDSC 存在于 TME 中時,它們會導致針對腫瘤細胞的免疫反應降低。研究表明,TME 中 MDSC 或 Treg 的耗竭可以逆轉 ICB 治療耐藥性,腫瘤細胞及其周圍基質可以共同調節免疫抑制微環境,從而導致對 ICB 治療產生耐藥性[51-53]。

3 Treg 細胞在 ICI 免疫治療中的作用

Treg 細胞靶向免疫療法和 ICI 的組合可以提高治療效果。抗 CTLA-4 mAb 可作用于 CD4+和 CD8+效應 T 細胞并重新激活其腫瘤免疫功能,然而,據報道,抗 CTLA-4 單克隆抗體的抗腫瘤功效隨著抗 CTLA-4 單克隆抗體 Fc 部分的耗盡而終止,這對于通過 ADCC 活性耗盡 Treg 細胞的方法至關重要,表明Treg細胞TME 中的耗竭是抗 CTLA-4 mAb 的重要抗腫瘤機制[54]。目前已經成功制備出一種攜帶新的抗CTLA-4抗體的溶瘤病毒,以增強Treg細胞耗竭的效力[55]。此外,由抗CTLA-4mAb單體和信號調節蛋白α(SIRPα)組成的異二聚體抗體通過阻斷SIRPα-CD47信號,增強Treg細胞耗竭效力[56]。因此,抗CTLA-4 mAb的抗腫瘤作用主要是由于其特異的消除了TME中表達CTLA-4的Treg細胞。

4 TME中癌基因的改變與Treg細胞的調節

新抗原是由腫瘤細胞突變基因編碼的新抗原,是一種主要由基因點突變、缺失突變和基因融合產生的異常肽。其結構不同于正常細胞表達的結構[57]。在抗腫瘤免疫的壓力下,腫瘤抗原減少或丟失。這個過程被稱為抗原調節,使腫瘤細胞能夠逃避免疫識別和殺傷。腫瘤疫苗目前也是研究的一大熱點。目的是將腫瘤抗原(包括腫瘤細胞、腫瘤相關蛋白或多肽、表達腫瘤抗原的基因)引入患者體內,增強免疫原性,激活患者自身免疫系統,誘導機體免疫反應,從而控制或消除腫瘤[58]。癌細胞中的基因改變可調節 TME 中的免疫狀態。在小鼠癌癥(鱗狀細胞癌)模型中,粘著斑激酶 (FAK) 通過調節TME中 CCL5 的表達和 CD8+T細胞的耗竭來募集Treg細胞。FAK 抑制劑通過抑制 Treg 細胞募集來增強抗腫瘤免疫反應。在人體中,EGFR(表皮生長因子受體)突變的 NSCLC具有免疫抑制性的 TME(高水平的 Treg 細胞和低水平的 CD8+T 細胞)。NSCLC 細胞增加 CCL22 的表達,吸引 TME 中的 Treg 細胞,而CD8+T 細胞通過抑制 CXCL10 和 CCL5 的產生來減少Treg細胞的浸潤。EGFR-TKI(酪氨酸激酶抑制劑)治療通過抑制 NSCLC 細胞產生 CCL22 來減少 TME 中的 Treg 細胞。抑制 EGFR 信號傳導可提高抗 PD-1 抗體在EGFR突變腫瘤動物模型中的治療效果[59]。在胃癌患者中,與CD8+T 細胞相比,具有RHOA突變的癌細胞(胃癌的驅動基因)產生的游離脂肪酸被 Treg 細胞有效吸收,從而導致 TME 中 Treg 細胞的增加。此外,RHOA突變的癌細胞產生的 CXCL10 和 CXCL11 水平低于正常細胞。富集于TME中的 Treg 細胞在一定程度上削弱了胃癌患者的抗腫瘤免疫反應[60]。因此,在一些致癌驅動突變的癌癥中,癌癥免疫療法和調節腫瘤細胞內在信號的分子靶向療法相結合,可能為癌癥免疫療法有效恢復抗腫瘤免疫反應創造條件。

5 未來與展望

Treg 細胞對維持免疫穩態有很大貢獻。在癌癥環境中,Treg 細胞還在癌細胞的免疫逃逸中發揮重要作用。因此,Treg 細胞的選擇性耗竭增強了多種癌癥類型的抗腫瘤免疫反應。然而,通過Treg 細胞耗竭提供抗腫瘤免疫力的有效性仍不能保證,并可能誘發有害的 irAE,因此,迫切需要開發生物標志物,通過分析患者的標本來區分應答者和非應答者,并開發新型的選擇性的Treg細胞靶向療法,而新分子的發現關乎在單細胞水平探索 TME 中 Treg 細胞的最新實驗技術。此外,通過控制趨化因子環境和代謝微環境,各種基因改變參與建立免疫抑制性 TME,包括豐富的 Treg 細胞。未來可能會開發出基于癌細胞基因改變的Treg細胞靶向治療,誘導Treg細胞的激活/分化。