3例犬炎性乳腺癌的病理學(xué)診斷和組織學(xué)分級(jí)評(píng)價(jià)

高 蕊,石俊超,張 競,賈茜涵,馬 瑩,賀文琦,陸慧君

(吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林 長春 130062)

炎性乳腺癌(Inflammatory mammary carcinoma,IMC)是犬所患最具侵襲性的乳腺腫瘤類型之一,發(fā)病率在犬惡性乳腺腫瘤中占17.7%[1],患犬通常伴有全身水腫、紅斑、潰瘍和腫瘤區(qū)域疼痛等臨床特征,這些炎性特征與乳腺炎或嚴(yán)重皮炎較為相似,因此,僅通過臨床檢查無法進(jìn)行精確診斷,常需借助病理學(xué)技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測分析。本試驗(yàn)通過蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色和免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行組織病理學(xué)分析,結(jié)合臨床表現(xiàn)將3例病例確診為犬IMC。

1 材料與方法

1.1 病例基本信息 2019年10月—2022年11月,于吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院動(dòng)物病理解剖學(xué)實(shí)驗(yàn)室所收集的3例雌性犬疑似乳腺腫瘤臨床病例。

病例1:混種犬,雌性,未絕育,15歲,曾患腎病和胰腺炎。腫物位于右側(cè)第四、五乳腺之間,出現(xiàn)破潰(圖1A)。

圖1 病灶大體檢查Fig.1 Gross examination of lesionsA:病例1; B:病例2; C:病例3箭頭:腫瘤A:Case 1; B:Case 2; C:Case 3 Arrow:The tumor

病例2:吉娃娃,雌性,已絕育,11歲。腫物位于右側(cè)第五乳腺,出現(xiàn)破潰(圖1B)。

病例3:泰迪犬,雌性,未絕育,9歲。腫物位于最后一對(duì)乳腺,已發(fā)現(xiàn)2年,腫物出現(xiàn)表皮破潰(圖1C)。

1.2 主要試劑 甲醛(37%～40%)、乙醇(99.5%)、二甲苯(99.5%)、伊紅染色液、蘇木素染色液、碳酸鋰和中性樹膠封片劑,均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;石蠟,購自江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司;濃鹽酸,購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;全角蛋白(Pan-cytokeratin,Pan ck)抗體(貨號(hào):914204),購自Biolegend公司;角蛋白8(Cytokeratin 8,CK8)抗體(貨號(hào):GB11231)和血管性血友病因子(Von Willebrand factor,VWF)抗體(貨號(hào):GB11020),均購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 組織包埋機(jī)(KD-BM)和攤片機(jī)(KD-P),科迪儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品;石蠟切片機(jī)(RM2245)和病理組織切片刀(E0997),Leica Biosystem產(chǎn)品;包埋盒(EM102)和不銹鋼包埋盒底膜(80203-0002),江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司產(chǎn)品;電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9023A)和水浴鍋(KD-8D),上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;掃描儀(250/MIDI),3D Histech Panoramic產(chǎn)品;水平搖床(KJ-201BD),吉林庫美生物科技有限公司產(chǎn)品;光學(xué)顯微鏡(TS100),上海尼康儀器有限公司產(chǎn)品;制冰機(jī)(IMS-40),常熟雪科雪花制冰機(jī)產(chǎn)品;分析天平(TP-A200),福建華志電子科技有限公司產(chǎn)品。

1.4 蘇木精-伊紅染色 將手術(shù)切除的乳腺腫物置于10%中性福爾馬林固定液中固定24 h以上。修塊后將組織置于包埋盒中,放入100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%、90%、80%和70%乙醇溶液中,各脫水30 min;然后放入二甲苯Ⅰ和Ⅱ溶液各透明30 min;分別3次放入65 ℃石蠟溶液中,各透蠟40 min,取出后于組織包埋機(jī)中進(jìn)行包埋。利用石蠟切片機(jī)將石蠟塊切成厚度為3 μm的切片,置于42 ℃水浴鍋中展片,待切片展平后貼于載玻片上,放入65 ℃烘箱中烤30 min。將3 μm的石蠟切片脫蠟,復(fù)水,進(jìn)行H.E.染色,經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后,滴加中性樹膠封片,自然晾干24 h,于光學(xué)顯微鏡下觀察腫物的組織病理學(xué)變化。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片脫蠟復(fù)水,在檸檬酸鈉緩沖液中煮沸20 min進(jìn)行抗原修復(fù),滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑,磷酸鹽吐溫緩沖液(Phosphate buffer solution tween,PBST)沖洗后,使用正常動(dòng)物非免疫血清進(jìn)行封閉,選擇Pan ck抗體、CK8抗體和VWF抗體作為一抗,4 ℃孵育過夜,PBST沖洗后滴加生物素標(biāo)記的二抗,孵育10 min,PBST沖洗3次后滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶,PBST沖洗3次,滴加DAB顯色液進(jìn)行顯色,自來水沖洗終止顯色,用蘇木精進(jìn)行復(fù)染,于光學(xué)顯微鏡下觀察組織中陽性產(chǎn)物的表達(dá)位置。

2 結(jié)果

2.1 蘇木精-伊紅染色 3例病例的病理組織學(xué)特征具有一定的相似性,即腫瘤均位于皮下,表皮發(fā)生潰瘍(圖2A),腫瘤內(nèi)部可見大小不一的巢狀結(jié)構(gòu)(圖2B)。深部的腫瘤細(xì)胞排列呈腺體結(jié)構(gòu)或?qū)嵭詬u狀或篩狀結(jié)構(gòu),邊緣由多層大小不一的腺上皮細(xì)胞構(gòu)成,細(xì)胞之間界限不清,細(xì)胞呈圓形至多角形,胞漿豐富,核仁清晰,可見中央泡狀核,細(xì)胞和胞核異型性高,有絲分裂常見,形成管狀癌或致密型癌(圖2C和2D);部分腫瘤形成的管腔非常小,呈圓形或不規(guī)則形,聚集在一起形成篩狀癌的特征(圖2E);部分腺體區(qū)域中央為脫落的上皮細(xì)胞并混有壞死的細(xì)胞碎片,形成干酪樣壞死區(qū),具有粉刺性癌的特征(圖2F)。淋巴結(jié)內(nèi)部充滿侵犯的腫瘤細(xì)胞(圖2G);腫瘤邊緣真皮內(nèi)的淋巴管明顯擴(kuò)張,管內(nèi)出現(xiàn)大量腫瘤細(xì)胞栓子(圖2H和2I)。

圖2 H.E.染色顯微鏡觀察Fig.2 H.E. staining microscopic observationA:腫瘤區(qū)域表皮發(fā)生潰瘍; B:腫瘤內(nèi)部排列紊亂; C:腫瘤細(xì)胞排列呈腺體樣結(jié)構(gòu); D:腫瘤細(xì)胞排列呈實(shí)性島狀結(jié)構(gòu)(紅圈:有絲分裂象); E:腫瘤細(xì)胞排列呈篩狀結(jié)構(gòu); F:腫瘤細(xì)胞形成粉刺性癌; G:淋巴結(jié)內(nèi)充滿侵犯的腫瘤細(xì)胞; H、I:真皮淋巴管明顯擴(kuò)張,管內(nèi)出現(xiàn)大量腫瘤細(xì)胞栓子A: Ulceration in the epithelium of the tumor area; B: Disordered arrangement inside the tumor; C: Tumor cells arranged in glandular-like structures; D: Solid island-like arrangement of tumor cells (red circle: mitosis); E: Tumor cells arranged in cribriform structures; F: Tumor cells forming comedocarcinoma; G: Lymph node filled with invasive tumor cells; H, I: Marked dilation of dermal lymphatic vessels, with numerous tumor cell emboli inside the vessels

2.2 免疫組織化學(xué)染色 為了進(jìn)一步證實(shí)3例病例腫瘤細(xì)胞的來源,選擇Pan ck、CK8和VWF抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示,3例病例Pan ck染色后腫瘤細(xì)胞胞漿均呈陽性(圖3A和3B);CK8染色后腫瘤細(xì)胞胞漿呈陽性(圖3C和3D);VWF染色后內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)呈陽性,證實(shí)這些腫瘤細(xì)胞均位于淋巴管/血管內(nèi)(圖3E和3F)。

圖3 免疫組織化學(xué)染色顯微鏡觀察Fig.3 Immunohistochemical staining microscopic observationA:病例3 Pan ck免疫組織化學(xué)染色; B:病例2 Pan ck免疫組織化學(xué)染色; C、D:病例1 CK8免疫組織化學(xué)染色; E:病例2 VWF免疫組織化學(xué)染色; F:病例1 VWF免疫組織化學(xué)染色A:Immunohistochemical staining of Pan ck in case 3; B:Immunohistochemical staining of Pan ck in case 2; C,D:Immunohistochemical staining for CK8 in case 1; E:Immunohistochemical staining for VWF in case 2; F:Immunohistochemical staining for VWF in case 1

2.3 綜合診斷 經(jīng)過H.E.染色和免疫組織化學(xué)染色,證實(shí)3例病例的腫瘤細(xì)胞均為腺上皮起源,腫瘤灶中存在幾種不同的生長模式,如管狀、實(shí)性、篩狀和粉刺性,且淋巴管和血管內(nèi)存在大量腫瘤細(xì)胞栓子,腫瘤細(xì)胞均具有極高的異型性,分化程度差;結(jié)合臨床特征(術(shù)前腫瘤出現(xiàn)潰瘍和紅腫)進(jìn)行綜合診斷,3例病例均符合炎性乳腺癌的特征。

根據(jù)Pena分級(jí)系統(tǒng)[2],以導(dǎo)管形成、核異型性和有絲分裂數(shù)為評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)導(dǎo)管形成范圍大于75%時(shí),評(píng)分為1分;當(dāng)導(dǎo)管形成范圍為10%～75%時(shí),評(píng)分為2分;當(dāng)導(dǎo)管形成范圍小于10%時(shí),評(píng)分為3分。若核均勻規(guī)則,偶見核仁,評(píng)分為1分;若核大小和形狀具有中等程度差異,核深染,存在核仁,評(píng)分為2分;若核大小差異明顯,核深染,常有1個(gè)或多個(gè)明顯的核仁,評(píng)分為3分。在10個(gè)高倍視野下,有絲分裂數(shù)0～9個(gè)為1分,10～19個(gè)為2分,大于20個(gè)為3分。三者相加,若總評(píng)分在3～5分為Ⅰ級(jí),總評(píng)分在6～7分為Ⅱ級(jí),總評(píng)分在8～9分為Ⅲ級(jí)。在此標(biāo)準(zhǔn)下,將病例1診斷為Ⅲ級(jí)炎性乳腺癌,病例2和病例3均診斷為Ⅱ級(jí)炎性乳腺癌(表1)。

表1 犬炎性乳腺癌分級(jí)評(píng)分Table 1 Grading scores for canine inflammatory mammary carcinoma

3 討論

人類炎性乳腺癌(Human inflammatory breast carcinoma,HIBC)最初是用于描述一種特殊類型的人類乳腺癌,臨床表現(xiàn)類似于皮炎或乳腺炎,該腫瘤具有發(fā)病率低和死亡率高的特點(diǎn)[3]。1983年,Susaneck等[4]報(bào)道了10只雌性自發(fā)IMC的患犬,因其與HIBC表現(xiàn)相似的臨床和病理學(xué)特征而得名。IMC是一個(gè)臨床病理學(xué)的術(shù)語,包含一類腫瘤實(shí)體,例如致密型乳腺癌(Solid carcinoma)、管狀乳突癌(Tubulopapillary carcinoma)、未分化癌(Anaplastic carcinoma)和富含脂質(zhì)的癌(Lipid-rich carcinoma)等[5],此類腫瘤特征為生長迅速[6],皮膚紅、腫、熱、痛,觸感堅(jiān)硬,外觀與急性乳腺炎或皮炎相似。IMC的典型組織病理學(xué)特征為真皮淋巴管內(nèi)出現(xiàn)腫瘤栓子,由于腫瘤栓子阻塞淋巴管導(dǎo)致臨床出現(xiàn)紅、腫、熱、痛的特征,部分病例由于腫瘤細(xì)胞侵犯鄰近的表皮而導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)潰瘍。該病的診斷依賴于臨床特征與病理組織學(xué)特征結(jié)合。

IMC是一種具有高轉(zhuǎn)移潛力和低生存率的侵襲性癌癥,常伴有腫瘤栓子侵犯淋巴管,這種特征通常會(huì)使患病動(dòng)物預(yù)后較差。本文的3例犬IMC病例在組織學(xué)上具有相似的特征,多數(shù)腫瘤形成廣泛的小管,腫瘤細(xì)胞大小不一、形態(tài)各異,具有明顯的核異形性和高有絲分裂數(shù),并伴有淋巴管擴(kuò)張,腫瘤栓子浸潤淋巴管,該結(jié)果與Jong-Hyuk等[7]確診的西施犬炎性乳腺癌所描述的病理組織學(xué)特征相吻合。

本文中3例IMC患犬均表現(xiàn)出嚴(yán)重的真皮淋巴管浸潤,且病例2出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞侵犯淋巴結(jié)的現(xiàn)象,符合IMC病理診斷的組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。與以往報(bào)道不同之處在于,本文3例病例在組織學(xué)上除表現(xiàn)管狀癌外,均出現(xiàn)典型的粉刺性癌、致密型癌和篩狀癌等不同的生長模式。由于粉刺性癌在組織學(xué)上也常出現(xiàn)嚴(yán)重的淋巴管和血管浸潤,所以,需要一個(gè)界定值來區(qū)分粉刺性癌和炎性乳腺癌。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,當(dāng)粉刺模式占腫瘤細(xì)胞群的50%以上,可診斷為粉刺性癌[8]。而本文的3例病例雖有粉刺性癌的生長模式,但占比約30%,不足以診斷為粉刺性癌。因此,此占比指數(shù)(50%)可用于在組織學(xué)上鑒別粉刺性癌與炎性乳腺癌。

病理組織學(xué)診斷是腫瘤診斷中最重要的一個(gè)環(huán)節(jié),對(duì)于一些分化程度差,尤其是特殊上皮型乳腺癌需要進(jìn)一步應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行診斷。本試驗(yàn)在H.E.染色的基礎(chǔ)上進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,以確定腫瘤細(xì)胞的起源,評(píng)估腫瘤栓子是否侵入淋巴管/血管內(nèi)。對(duì)存在于上皮組織胞漿中特異性的Pan ck進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,證明3例病例的腫瘤細(xì)胞均來源于上皮細(xì)胞;對(duì)存在于腺上皮組織胞漿中特異性的CK8進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,證明3例病例的腫瘤細(xì)胞均來源于腺上皮;對(duì)存在于內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿中特異性的VWF進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,證實(shí)淋巴管內(nèi)出現(xiàn)腫瘤栓子。三者聯(lián)合應(yīng)用,可對(duì)組織和細(xì)胞中的抗原進(jìn)行準(zhǔn)確定位,從而確定原發(fā)部位,預(yù)測腫瘤的預(yù)后。雖然淋巴管侵犯是IMC的組織學(xué)標(biāo)志,但并不具備特異性[8],需要與臨床特征相結(jié)合以達(dá)到精確診斷。

腫瘤的組織學(xué)分類和良惡性是反映腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征和生物學(xué)行為的重要參數(shù),惡性腫瘤的組織學(xué)分級(jí)常能反映腫瘤的分化程度,是疾病轉(zhuǎn)歸的重要預(yù)測因子;分級(jí)越高的腫瘤越具有侵襲性,低級(jí)別腫瘤通常比高級(jí)別腫瘤生長更慢,不容易發(fā)生擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移[9]。在人類醫(yī)學(xué)中,組織學(xué)類型和分級(jí)共同評(píng)估比單獨(dú)的組織學(xué)類型更能準(zhǔn)確地判斷乳腺癌的預(yù)后情況。同樣,在犬中,腫瘤的分型結(jié)合分級(jí)可以比較準(zhǔn)確的預(yù)測不同類型腫瘤特有的生物學(xué)行為和侵襲轉(zhuǎn)移能力[10]。本文所分析的3例犬IMC,在組織學(xué)分型的基礎(chǔ)上應(yīng)用Pena分級(jí)系統(tǒng),通過觀察乳腺腫瘤的導(dǎo)管形成、核異型性和有絲分裂數(shù)來評(píng)估其分級(jí),結(jié)果顯示,3例犬IMC組織學(xué)分級(jí)為Ⅱ級(jí)或Ⅲ級(jí),表明其分化程度差,有擴(kuò)散轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn),通常預(yù)后不良。

由于腫瘤細(xì)胞阻塞皮膚淋巴管,導(dǎo)致IMC患犬出現(xiàn)水腫、紅斑、潰瘍、乳腺堅(jiān)硬、溫?zé)?或伴有乳腺結(jié)節(jié),并涉及腋窩、乳腺和腹股溝區(qū)域的疼痛。雖然這些特征與乳腺炎和皮炎等炎癥性疾病的臨床癥狀相似,但在IMC中,炎癥細(xì)胞浸潤并不常見[11]。臨床上現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)原發(fā)性和繼發(fā)性2種IMC,原發(fā)性IMC發(fā)生在無乳腺腫瘤病史的患犬,繼發(fā)性IMC發(fā)生在有乳腺腫瘤病史的患犬,原發(fā)性IMC更具侵襲性,生長速度更快,預(yù)后較差[12-13]。在現(xiàn)有的治療手段中,手術(shù)切除仍是治療犬IMC的首選方法,由于IMC是一種侵襲性的腫瘤性疾病,并伴有廣泛的炎癥表現(xiàn),手術(shù)邊緣難以確定,存在不完全切除的風(fēng)險(xiǎn)。所以,僅依靠手術(shù)治療往往無法緩解,并有復(fù)發(fā)的可能性,應(yīng)進(jìn)一步實(shí)施輔助化療、放療或舒減療法[14]。一項(xiàng)臨床研究顯示,使用非選擇性環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)抑制劑,并單獨(dú)或聯(lián)合使用其他化療藥物,如卡鉑(Carboplatin)、卡霉素(Doxorubicin)、卡培他濱(Capecitabine)或順鉑(Cisplatin)治療IMC有更好的效果[15-16]。

本試驗(yàn)的3例犬炎性乳腺癌病例的病理學(xué)診斷和組織學(xué)分級(jí)評(píng)價(jià)結(jié)果不僅為IMC的病理診斷提供重要依據(jù),而且為臨床病例治療方案的制定和預(yù)后評(píng)估提供參考。由于犬IMC與HIBC具有相似的臨床、病理和分子疾病模式[17],本試驗(yàn)也可為HIBC的研究提供一定的參考價(jià)值。