長沙生態動物園野生動物衣原體感染情況調查

張 林,曾光哲,王 文,張衛忠,邱啟官,尹 崇,胡仕鳳

(1. 湖南農業大學動物醫學院,湖南 長沙 410128 ; 2. 株洲市動物疫病預防控制中心,湖南 株洲 412007 ; 3. 長沙生態動物園,湖南 長沙 410004)

衣原體(Chlamydia)是一種介于細菌和病毒之間的專性細胞內寄生微生物,具有獨特的雙相發育周期,是重要的人獸共患病原體。衣原體宿主極其廣泛,包括人、各種哺乳動物和禽鳥類[1]。病原體主要隨鼻、眼等的分泌物和排泄物排出體外,污染環境,經呼吸道、消化道、泌尿生殖道甚至損傷的皮膚黏膜感染,在哺乳動物和禽鳥類之間、哺乳動物和哺乳動物之間以及禽鳥類和禽鳥類之間互相傳播[2]。人類感染衣原體可導致失明、流產、腸炎和肺炎等多種病癥,鸚鵡熱衣原體感染甚至可導致人死亡[3]。動物園動物種類繁多,人流量大(特別是節假日),在有限的空間里面,人與動物必然有直接或間接的接觸,存在較大的染病風險。因此,了解衣原體在長沙生態動物園野生動物中的感染情況尤其重要,可為盡早采取有效防控措施提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品的采集 在長沙生態動物園園區內,共采集了共計63種動物的231份新鮮糞便樣品(表1),低溫運送至實驗室后,-20 ℃凍存備用。

表1 野生動物衣原體的PCR檢測結果Table 1 PCR detection results of Chlamydia in wild animals

1.1.2 引物設計 根據中華人民共和國農業行業標準《動物衣原體病診斷技術》(NY/T 562—2015)[4]設計引物,用于擴增衣原體外膜蛋白A(Outer membrane protein A,ompA)基因片段,ompA基因片段具有4個相對保守區,可用于衣原體的鑒別診斷。第一次擴增引物:MP1:5′-ATGAAAAAAC-TCTTGAAATCGG-3′,MP2:5′-TTAGAATCTGAATTGAGCATTCAT-3′;第二次擴增引物:MP3:5′-CAGGATACTACGGAGATTATGTTT-3′,MP4:5-GATTAGA-TTGAGCGTATTGGAA-3′,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,二擴目的片段大小為480 bp。

1.1.3 陽性對照 陽性對照1為根據衣原體ompA基因合成的陽性質粒,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;陽性對照2為豬衣原體DNA(與P1309株相似度為99%),由本實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品DNA制備 按糞便DNA 提取試劑盒(天根)使用說明書操作提取基因組總DNA,作為PCR反應的模板。

1.2.2 PCR檢測 巢式PCR反應體系采取25 μL體系,第一次擴增體系為1.1×T3 Super PCR Mix 22 μL,MP1 0.5 μL,MP2 0.5 μL,模板(被檢樣品總DNA)2 μL;第二次擴增體系為1.1×T3 Super PCR Mix 23 μL,MP3 0.5 μL,MP4 0.5 μL,模板(第一次擴增產物) 1 μL。PCR反應條件參考《動物衣原體病診斷技術》(NY/T 562—2015)[4]。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 測序和序列分析 將第二次擴增陽性產物送北京擎科新業生物技術有限公司測序,測序結果用DNASTAR軟件進行拼接分析,在NCBI中BLAST進行同源性比對,使用MEGA 7.0軟件構建系統進化樹。

2 結果

2.1 PCR檢測 根據《動物衣原體病診斷技術》(NY/T 562—2015)[4],利用巢式 PCR 方法對所采集63種動物的 231 份糞便樣品進行檢測,結果如表1所示,共檢測出13份陽性樣品(部分樣品的PCR電泳結果如圖1所示),分別是綠孔雀(1/18)、紅綠金剛鸚鵡(1/3)、豚尾猴(1/1)、赤猴(2/6)、狒狒(1/2)、黑白疣猴(1/1)、長臂猿(1/4)、羚羊(2/3)、東北虎(1/12)和水豚(2/3)共10種動物,總陽性率為5.63%(13/231),其中植食類動物陽性率為11.43%(4/35)、靈長類動物陽性率為13.95%(6/43)、禽鳥類動物陽性率為3.13%(2/64)、肉食類動物陽性率為1.12%(1/89)(表2)。從動物種類來說,陽性動物種類占比15.87%(10/63),主要集中在靈長類動物,11種靈長類動物中有5種檢出陽性,占比45.45%,其他類型動物均只有1～2種動物檢出陽性(表2)。

圖1 衣原體ompA基因的巢式PCR擴增Fig.1 Nested PCR amplification of ompA gene from ChlamydiaM:DL-2 000 DNA 相對分子質量標準; 2:綠孔雀樣本; 1、3～10:其他動物樣本; 11:陰性對照; 12～13:陽性對照M:DL-2 000 DNA Marker; 2:Sample of Pavo muticus; 1,3-10:Samples of other animals; 11:Negative control; 12-13:Positive control

表2 衣原體感染陽性率統計分析Table 2 Statistical analysis of Chlamydia infection positive rate

使用SPSS 22.0軟件,將禽鳥類、靈長類、植食類和肉食類動物的PCR檢測結果分別與其余各組之和進行統計學分析,結果如表2所示,在本次調查中,禽鳥類動物的優勢比(Odds ratio,OR)=0.46<1、χ2=1.04,說明感染風險較低,但不具有統計學意義(P>0.05);靈長類動物的OR=4.19>1、χ2=6.90,說明感染風險極顯著高于其他動物(P<0.01);植食類動物的OR=2.68>1、χ2=2.61,說明感染風險較高,但不具有統計學意義(P>0.05);肉食類動物的OR=0.12<1、χ2=5.53,說明感染風險顯著低于其他動物(P<0.05)。

2.2 測序和序列分析 將第2次擴增陽性產物送北京擎科新業生物技術有限公司基因測序,僅以1份綠孔雀陽性樣品中獲得有效的衣原體序列,該衣原體序列已上傳至GenBank,登錄號為OK033359.1。

將測序結果使用https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/網站進行對比發現,該序列與Chlamydiagallinacea(C.gallinacea)基因相似度在95%以上,其中與美國分離株c149(序列號:KY206900.1)相似度最高,為99.72%,因而可以確定該綠孔雀感染的衣原體應該是最近發現的1個衣原體新種——C.gallinacea。

下載國內外報道的14個C.gallinacea基因序列:KY206900.1(美國)、HE660104.1(法國)、KT203207.1(山東)、KT203208.1(山東)、KT203198.1(云南)、KT203199.1(云南)、KT203196.1(浙江)、KT203203.1(廣東)、KT203205.1(廣東)、KT203204.1(廣東)、KT203202.1(廣東)、KT203201.1(四川)、KT203200.1(四川)和KT203211.1(海南),使用MEGA 7.0軟件構建系統進化樹,結果如圖2所示,從綠孔雀糞便樣品中發現的C.gallinacea與美國發現的衣原體菌株(KY206900.1)處于同一分支,同時與我國山東的2株分離株(KT203207.1和KT203208.1)有著較近的親緣關系,而與廣東、四川、云南、浙江和海南等地報道的C.gallinacea親緣關系相距較遠。并且從進化時間上來說,這應該是1株進化較早的C.gallinacea。

圖2 基于C.gallinacea ompA基因的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on ompA gene from C.gallinacea▲:本試驗所得的分離株▲:The strain isolated in this study

3 討論

本次在長沙生態動物園調查的共計63種動物的231份糞便樣品中,共發現13份樣品呈衣原體陽性,總陽性率為5.63%(13/231),相較于陳仁鋒等[5]在福州市野生動物園通過血清學檢測所得的衣原體感染率(24.42%,32/132)和Feng等[6]在云南省昆明市動物園通過TaqMan MGB探針熒光定量聚合酶鏈反應檢測所得的鸚鵡熱衣原體感染率(11.7%,7/60),本動物園野生動物衣原體的感染率相對較低。雖然本園樣品采集和檢測方法與上述兩園存在差異,不具備很好的對比性,但長沙生態動物園為新建園區,2010年才建成投入使用,場館設施均較新,日常消毒防疫工作比較到位,像衣原體這種自然疫源性傳染病病原體存在較少,可能是感染率低的主要原因。

由于采樣的限制,每種動物的樣品采集量非常有限,許多樣品都是孤樣,導致部分動物的陽性率偏高,不具有代表性。但從動物大類來看,本次檢測該園中感染風險最高的是靈長類動物,感染的動物種類(5/11)明顯高于其他類動物。通過統計學分析可知,不同的動物種類是感染衣原體的風險因素之一,其中肉食類動物的感染風險較低,靈長類動物的感染風險顯著高于本次調查的其他動物。可能是由于圈養肉食類動物的食物均來自經過嚴格檢驗的肉類,致使食源性衣原體感染率較低。在飼養管理方面,該園內靈長類動物的活動區與肉食類動物大小接近,但種群密度遠大于肉食類動物,且靈長類動物個體之間的接觸更為頻繁,可能是導致感染率較高的原因之一。而靈長類動物的衣原體感染風險是否與親緣關系的遠近有關,是否對人類存在較大威脅,有待進一步研究。

本試驗從綠孔雀糞便樣品中檢測到的衣原體是近年發現的衣原體新種C.gallinacea,這在國內動物園飼養的孔雀體內屬首次發現,且該衣原體還處在C.gallinacea進化的較早時期。C.gallinacea于2014年由Sachse K 和Laroucau K等[7]發現并命名,當時所有的C.gallinacea菌株均來源于雞,所以,目前國內部分文獻將其譯為家禽衣原體或禽衣原體[2,8-9]。但是,隨著對該衣原體的深入研究,發現C.gallinacea不僅只感染家禽,Li 等[10]對我國11個省奶牛和肉牛中衣原體的調查結果顯示,牛的C.gallinacea感染率為20.8%;Stokes 等[11-12]在澳大利亞的野生鳥類中也發現了該衣原體;Laroucau等[13]報道2008年法國一家禽屠宰場工人曾發生的不明原因非典型肺炎,后來也被證實與C.gallinacea感染雞密切接觸有關。這些研究表明,C.gallinacea不僅只流行于家禽,對其他動物(包括人類)也可造成感染,應引起重視。不過,有金鳳等[2,14]對C.gallinacea的傳播方式進行了研究,發現該種衣原體的傳播途徑主要為糞口傳播和垂直傳播,并不會經呼吸道傳播。動物園飼養管理人員只要加強個人防護,搞好環境衛生,及時清除糞便;游客在動物園游玩時盡量避免與動物直接接觸,不隨意到處亂摸,即可降低感染風險。

衣原體病屬于人獸共患病,而動物園野生動物屬于保護動物,不能隨意淘汰。因此,對于確診感染衣原體的動物,動物園在做好環境消殺和動物隔離的同時,一定要及時選擇敏感藥物進行治療,如四環素、強力霉素、土霉素、泰樂菌素和螺旋霉素等,同時還要考慮交替用藥,防止出現耐藥性。