百里香酚對犢牛源生物被膜陽性金黃色葡萄球菌耐藥性的消除作用

趙紅霞,顧珂瑞,宋 晨,李培鋒,孫 月,樊宏亮,郭 宇,徐文琦

(1. 內蒙古農業大學獸醫學院,內蒙古 呼和浩特 010010 ; 2.內蒙古優然牧業有限責任公司,內蒙古 呼和浩特 010010 ;3.內蒙古動物疾病預防控制中心,內蒙古 呼和浩特 010010)

金黃色葡萄球菌(Staphylocococcusaureus)是葡萄球菌屬的一員,其在自然界中無處不在,如空氣、水、灰塵和人畜糞便中,可引起人類和動物發生各種疾病,包括偽膜性腸炎、敗血癥和膿毒癥等[1]。牛源金黃色葡萄球菌是引起牛臨床疾病的主要致病微生物,可以引起奶牛子宮內膜炎、乳腺炎和細菌性腦膜炎等各種疾病,該菌感染給畜牧養殖業造成經濟損失,也對其健康發展造成威脅[2-3]。

細菌生物被膜[又被稱為細菌生物膜(Bacterial biofilm)]是細菌粘附于接觸表面后,分泌多糖基質、纖維蛋白和脂質等使細菌粘連在一起,進行自身克隆聚集纏繞其中形成的膜樣物[4]。細菌在惡劣的環境中為了更好地存活,它們就會形成生物被膜。由于生物被膜的存在,許多細菌感染性疾病都很難治愈且易反復發作,而且往往需要長時間的治療才能痊愈。在感染性疾病中,金黃色葡萄球菌是一種較為普遍的致病菌,它可以利用被膜多糖來躲避宿主對其的吸收[5]。

百里香酚(ThymusmongolicusRonn,Thymol),又稱2-異丙基-5-甲基苯酚和麝香草酚等,其是一種單萜類化合物,因在百里香中被發現而得名。百里香酚呈無色結晶狀,有辛香、草藥的氣味,在水中微溶解,在冰醋酸、石蠟油、乙醇和乙醚中溶解[6-7]。近些年來,百里香酚在臨床醫學中一直被廣泛應用,并且研究表明其具有多種生物活性,如殺菌、抗炎、抗氧化和除螨等[8-9]。本試驗對從內蒙古地區牧場采集得到的犢牛病料進行金黃色葡萄球菌的分離和鑒定;通過體外藥敏試驗測定臨床金黃色葡萄球菌分離株的耐藥情況及其中的生物被膜陽性株的多重耐藥性,并進一步對百里香酚的耐藥性消除作用進行分析,以期對臨床合理用藥和治療生物被膜陽性金黃色葡萄球菌感染提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源 病料來源于2019年3月—2020年1月從內蒙古地區某幾大牧場采集的流涕犢牛的鼻拭子37份,口腔潰瘍犢牛的口腔拭子13份和腹瀉犢牛的糞便拭子 54 份,共104份樣品。金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC 25923,由內蒙古農業大學獸醫藥理學與毒理學實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 普通瓊脂培養基、營養肉湯培養基、MH肉湯培養基、葡萄球菌屬細菌生化鑒定管和高鹽甘露醇瓊脂培養基,均購自青島高科園海博生物技術有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒、50×TAE緩沖液、瓊脂糖和藥敏紙片[氨芐西林(Ampicillin)、美羅培南(Meropenem)、頭孢噻吩(Cephalothin)、頭孢吡肟(Cefepime)、頭孢噻肟(Cefotaxime)、頭孢西丁(Cefoxitin)、米諾環素(Minocycline)、四環素(Tetracycline)、多西環素(Doxycycline)、氧氟沙星(Ofloxacin)、環丙沙星(Ciprofloxacin)、加替沙星(Gatifloxacin)、左氧氟沙星(Levofloxacin)、阿米卡星(Amikacin)、卡那霉素(Kanamycin)、慶大霉素(Gentamycin)、復方新諾明(Compound sulfamethoxazole)和紅霉素(Erythromycin)],均購自中國獸醫藥品監察所;百里香酚[純度>98%,色譜純],購自成都瑞芬思生物科技公司。

1.1.3 主要儀器 高壓滅菌鍋,購自日本HIRAYAMA公司;紫外可見分光光度計,購自北京普析通用儀器有限責任公司;風熱高溫烘干箱,購自上海福瑪實驗設備有限公司;智能生化培養箱(SPX-160),購自寧波江南儀器廠;恒溫振蕩培養箱(HZC-250),購自太倉市實驗設備廠;電子天平(Acculab ACL),購自德國賽多科斯股份公司;超凈工作臺(S.SW-CJ-1F),購自上海躍進醫療器械有限公司;多功能酶標儀(Synergy HT),購自美國伯騰儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 犢牛源金黃色葡萄球菌的分離和鑒定 將病料接種于營養肉湯培養基中,37 ℃下培養18～24 h,通過革蘭染色鏡檢犢牛源金黃色葡萄球菌分離株,通過生化試驗和聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)方法對分離株進行鑒定。

1.2.2 藥物敏感性試驗 選用18種抗菌藥物進行犢牛源金黃色葡萄球菌分離株的藥敏試驗,按照 K-B法進行測定,依據美國臨床與實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institutes,CLSI) 2019年的標準進行結果判定[10]。根據犢牛源金黃色葡萄球菌分離株對各類抗菌藥物的體外藥物敏感性測定結果,確定分離菌株的耐藥表型,以便后續進行百里香酚的耐藥性消除試驗。

1.2.3 生物被膜形成能力測定 生物被膜形成能力的測定參照參考文獻[11],通過改進的結晶紫染色法進行。將200 μL犢牛源金黃色葡萄球菌分離株菌液按1∶100稀釋,添加到無菌96孔組織培養板中,陰性對照孔中僅添加等量的MH肉湯培養基。將培養板加蓋兒后,在37 ℃下培養24 h,棄去培養基,用250 μL無菌 PBS沖洗3遍,用99%甲醇固定15 min,棄去甲醇,使培養板自然干燥。用濃度為2%的結晶紫染色5 min,再用流水沖洗掉剩余的染料直到無色。在培養板自然干燥后,用33%冰醋酸將孔內結合的染料溶解,使用多功能酶標儀于570 nm處檢測各孔的光密度(Optical density,OD)值。試驗孔和陰性對照孔均進行3次重復,最后計算平均值作為測試結果。

生物被膜形成能力的判定標準:臨界值(ODc)=陰性對照孔的平均值+(3×陰性對照孔的標準差)。當OD570 nm≤ODc時,判定細菌沒有形成生物被膜的能力;當ODc4ODc時,判定細菌形成生物被膜的能力較強。

1.2.4 百里香酚最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)測定 選取2株具有強生物膜形成能力的牛源金黃色葡萄球菌分離株,即17和24號菌株,用微量肉湯稀釋法測定百里香酚對牛源金黃色葡萄球菌分離株的MIC。在96孔板第1～8孔加入質量濃度依次為1 024、512、256、128、64、32、16和8 mg/L的百里香酚,第9孔作為菌液對照孔(僅添加濃度為1.5×108CFU/mL的17或24號菌液),第10、11 孔作為空白對照孔(僅加入營養肉湯培養基),第12 孔作為藥物對照孔(僅添加百里香酚藥液)。試驗進行3次重復。將96孔板放入恒溫培養箱于37 ℃ 條件下靜置培養18～24 h,在黑色背景下觀察到沒有細菌生長的百里香酚最低濃度孔,孔內液體清亮,孔底無沉淀,則認定該孔所添加的百里香酚質量濃度即為MIC。

1.2.5 百里香酚耐藥性消除試驗 以亞抑菌濃度(即1/2MIC)進行百里香酚耐藥性消除試驗。在無菌試管中用營養肉湯培養基將百里香酚藥液濃度稀釋至1/2 MIC,同時設立營養肉湯培養基空白對照組,將培養好的生物被膜陽性株(選取17和24號菌株)和標準菌株稀釋至1.5×108CFU/mL,取100 μL 接種至各試管中,37 ℃ 恒溫培養,每間隔24 h 傳代接種;傳代3次后,分別取培養24、48和72 h的菌液和百里香酚藥液培養物,用 K-B 法測定犢牛源金黃色葡萄球菌耐藥株對頭孢噻肟耐藥表型的變化情況。

2 結果

2.1 犢牛源金黃色葡萄球菌的分離和鑒定 本試驗從104份犢牛樣品中分離鑒定得到 43株金黃色葡萄球菌,其中14 株從糞便拭子中分離得到,占比32.6%(14/43),9 株從口腔拭子中分離得到,占比 20.9%(9/43),20株從鼻腔拭子中分離得到,占比 46.5%(20/43)。

2.2 藥物敏感性試驗 結果如表1所示,犢牛源金黃色葡萄球菌分離株對氨芐西林和頭孢西丁耐藥率最高,分別為100%和 90.7%;對加替沙星、慶大霉素、美羅培南、左氧氟沙星和氧氟沙星較敏感,藥物耐藥率分別為14.0%、18.6%、18.6%、18.6%和18.6%,而對紅霉素、多西環素和米諾環素相對耐藥,耐藥率分別為53.5%、48.8%和46.5%;對氨基糖苷類藥物耐藥率介于18.6%～60.5%;大部分的犢牛源金黃色葡萄球菌分離株對喹諾酮類藥物比較敏感,耐藥率均低于20.0%。結果表明,內蒙古地區犢牛源金黃色葡萄球菌分離株對β-內酰胺類和四環素類藥物耐藥性較為嚴重,對喹諾酮類藥物較為敏感。

表1 金黃色葡萄球菌分離株的藥敏試驗結果Table 1 Drug susceptibility test results of Staphylococcus aureus isolates [n(%)]

2.3 生物被膜形成能力測定 43株金黃色葡萄球菌分離株的生物被膜形成能力檢測結果如表2所示,12株分離株沒有形成生物被膜的能力,占比27.9%;31株分離株具有形成生物被膜的能力,占比72.1%;其中10株分離株具有強生物被膜形成能力,占比23.3%;7株分離株形成生物被膜的能力屬于中等,占比16.3%;14株分離株的生物被膜形成能力較弱,占比32.6%。編號為1、2、4、14、15、17、18、23、24和40的分離株為強生物被膜形成能力菌株。

表2 金黃色葡萄球菌分離株生物被膜的形成情況Table 2 Biofilm formation of Staphylococcus aureus isolates [n(%)]

內蒙古地區犢牛源金黃色葡萄球菌分離株的多重耐藥情況見圖1,生物被膜陽性株的耐藥數均在3種以上,分別對6、8、9、10、11、13、15和17種藥物耐藥;生物被膜陰性株分別對2、3、5、7、10和11種藥物耐藥;在43株分離株中,對10種及10種以上藥物具有耐藥性的分離株有17株,其中11.8%(2/17)是生物被膜陰性株,88.2%(15/17)是生物被膜陽性株。

圖1 生物被膜陽性株和生物被膜陰性株的耐藥數Fig.1 Number of drug resistance in biofilm positive strains and biofilm negative strains

如圖2所示,43株分離株中74.4%(32/43)的菌株對3類或3類以上的藥物具有耐藥性,為多重耐藥株。生物被膜陽性株中83.9%(26/31)為多重耐藥菌株;在耐4類藥物的菌株中,生物被膜陽性株和生物被膜陰性株數量分別為6株和1株;在耐5類藥物的菌株中,生物被膜陽性株有9株,生物被膜陰性株只有1株。

圖2 生物被膜陽性株與生物被膜陰性株的耐藥種類Fig.2 Types of drug resistance in biofilm positive strains and biofilm negative strains

2.4 百里香酚MIC測定 經過微量肉湯稀釋法測定,百里香酚對17和24號菌株的MIC為256 mg/mL。

2.5 百里香酚耐藥性消除試驗 亞抑菌濃度的百里香酚與17和24號犢牛源金黃色葡萄球菌耐藥株作用24、48和72 h后,對頭孢噻肟的體外藥物敏感性測定結果見表3,17和24號菌株與百里香酚作用之前,頭孢噻肟對兩者的抑菌圈直徑分別為13和12 mm,2株分離株均呈現對頭孢噻肟的耐藥性。亞抑菌濃度的百里香酚與17和24號犢牛源金黃色葡萄球菌耐藥株作用24、48和72 h后,頭孢噻肟對17號耐藥株的抑菌圈直徑分別為16、22和27 mm;頭孢噻肟對24號耐藥株的抑菌圈直徑分別為16、24和28 mm。結果表明,亞抑菌濃度的百里香酚作用于17和24號耐藥株后,2株耐藥株對頭孢噻肟的敏感性均增強。在24～72 h的培養時間內,17號耐藥菌的抑菌圈直徑擴大了3～14 mm,24號耐藥菌的抑菌圈直徑擴大了4～16 mm,均由對頭孢噻肟的耐藥株轉變為敏感株。由此可知,百里香酚消除了犢牛源金黃色葡萄球菌對頭孢噻肟的耐藥性。

表3 百里香酚作用前后抑菌圈直徑和耐藥表型的變化Table 3 Changes of inhibition zone diameter and drug resistant phenotype before and after thymol treatment

3 討論

我國許多地區均有金黃色葡萄球菌分離株耐藥情況相關的報道。研究人員對內蒙古不同地區子宮內膜炎奶牛的子宮膿性分泌物進行了葡萄球菌的藥敏試驗,結果顯示,分離株對氨芐西林的耐藥率較高(71.7%),對克拉霉素、紅霉素和米諾環素的耐藥率也較高,耐藥率介于40.0%～50.0%[12],與本試驗結果相符。黑龍江齊齊哈爾市周邊某規模化牛場,從犢牛肝臟病料中分離得到金黃色葡萄球菌,藥敏試驗結果顯示,分離株對丁胺卡那高度敏感,對頭孢噻肟中度敏感,對多西環素和環丙沙星等具有耐藥性[2]。內蒙古某牛場隱性乳房炎奶牛牛乳中15株金黃色葡萄球菌對紅霉素的耐藥率為6.7%,對卡那霉素的耐藥率為13.3%[13]。本試驗結果顯示,金黃色葡萄球菌分離株對氨芐西林、頭孢西丁和復方新諾明的耐藥性較高,達80.0%以上。藥敏試驗中敏感性較高的藥物為喹諾酮類藥物,可以應用于該牧場犢牛金黃色葡萄球菌病的治療,但為了避免由于環境壓力引起耐藥株的出現,盡量避免長時間一直使用同一種藥物,可以選擇不同的抗菌藥物進行交替使用;本試驗結果顯示,內蒙古地區犢牛源金黃色葡萄球菌分離株對β-內酰胺類藥物已經產生了不同程度的耐藥性,其中對氨芐西林耐藥率高達100.0%,對頭孢西丁的耐藥率為90.7%,所以建議在該地區獸醫臨床中不要使用以上藥物治療犢牛源金黃色葡萄球菌引起的感染。本試驗結果顯示,金黃色葡萄球菌分離株對美羅培南、左氧氟沙星和氧氟沙星有相同的耐藥率(18.6%),對頭孢噻肟和頭孢噻吩的耐藥率也相同(27.9%),耐藥率均較低,因此對于內蒙古地區犢牛源金黃色葡萄球菌引起的感染可以使用以上比較敏感的藥物進行治療。本試驗中74.4%(32/43)金黃色葡萄球菌分離株為多重耐藥株,這與牧場頻繁使用抗菌藥物有一定關聯。由此可見,不同牧場的金黃色葡萄球菌分離株耐藥情況差異較大,這與不同的自然環境、不同的臨床用藥習慣、不同的抗菌藥物選擇壓力密切相關。因此,為了科學、有效地防控內蒙古地區犢牛源金黃色葡萄球菌引起的感染性疾病,首先應通過病原學檢測和體外藥物敏感性測定結果選擇敏感的抗菌藥物,加強用藥的目的性和有效性,同時也可在一定程度上避免耐藥性的產生。根據本試驗結果建議內蒙古地區的牧場在臨床上多選用喹諾酮類抗菌藥物。

本試驗結果顯示,生物被膜陽性株中的多重耐藥菌株數顯著多于生物被膜陰性株中的多重耐藥菌株數。犢牛源金黃色葡萄球菌分離株中74.4%(32/43)的菌株對3類或3類以上藥物具有耐藥性,為多重耐藥株。唐子云等對具有生物被膜形成能力的23株牛源金黃色葡萄球菌進行耐藥性試驗,結果顯示,生物被膜陽性株對試驗所用的青霉素、多西環素和復方新諾明等所有抗菌藥物均敏感[14],與本試驗結果有很大不同,可能由于樣品來源于不同的地區所導致。常佳偉等研究結果顯示,牛源金黃色葡萄球菌生物被膜陽性株耐藥性均高于生物被膜陰性株,在生物被膜形成后,細菌的耐藥數量也隨之增多,對3種以上藥物具有耐藥性的生物被膜陽性株數量大于生物被膜陰性株,而對1、2和3種藥物具有耐藥性的生物被膜陰性株數量多于生物被膜陽性株[15]。由于菌株多重耐藥性比較嚴重,臨床治療時選擇藥物的難度也會增大,使得疾病很難治愈,從而造成牧場的經濟損失。本試驗結果顯示,由于內蒙古地區犢牛源金黃色葡萄球菌生物被膜陽性株占比高,以及生物被膜陽性株耐藥性較強等原因,導致在臨床治療時可以選擇的抗菌藥物越來越少,且效果欠佳。

由于清熱類中藥具有抗炎和抑菌等作用,可以在畜牧業中將其應用,從而降低細菌的耐藥性,減少動物體內獸藥的殘留[16]。研究發現,清熱型中藥確實具有一定的消除細菌耐藥性的效果。袁中偉等的試驗證明,百里香酚對小鼠腹腔耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的早期生物被膜具有一定的清除作用[17]。本試驗根據犢牛源金黃色葡萄球菌分離株生物被膜形成能力檢測結果,選擇其中的17和24號生物被膜強陽性株進行后續的百里香酚耐藥性消除試驗,2株多重耐藥的生物被膜強陽性株經過百里香酚作用后,其體外藥物敏感性大幅度提高,對頭孢噻肟恢復了敏感性。百里香酚在一定程度上消除了強生物被膜形成能力菌株的耐藥性,使其對耐藥藥物恢復了敏感性,可以用于控制細菌感染性疾病。但是細菌的耐藥機理特別復雜,抗菌藥物的藥效和耐藥譜型的變化尚有待于進一步的分析;耐藥性與細菌的毒力、致病力之間的聯系還有待更進一步的討論;對能夠消除細菌耐藥性的藥物的具體成分還有待于深入的研究,以便為臨床上感染性疾病的防治提供參考依據。