復方中草藥對兔生長性能和腸道健康的影響

徐翔飛,黃 盼,崔雪梅,季權安,肖琛聞,韋 強,黃葉娥,鮑國連,劉 燕

(1. 浙江農林大學動物科技學院·動物醫學院,浙江 杭州 311300 ; 2. 浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所,浙江 杭州 310021)

在實際生產中,抗生素在控制病原菌和促進動物生長方面發揮了重要作用[1]。但抗生素濫用導致的細菌耐藥性和食品抗生素殘留等問題對動物和公共健康構成了重大威脅[2]。中草藥作為一種天然綠色的飼料添加劑,含有多種活性成分,具有無毒、無耐藥性、功能性強、經濟實用、不良反應小和無殘留等優點,可提高飼料轉化率,增強機體抗病能力、抗氧化應激能力和抗菌抗病毒功能,增強動物繁殖性能[3]。有研究認為,在飼糧中合理使用中草藥添加劑可以有效提高動物產品的安全性和質量以及動物免疫力[4]。腸道不僅是消化場所,腸道屏障功能對機體健康也有重要作用,腸道屏障包括腸黏膜上皮、腸道菌群和腸道緊密連接蛋白等。兔的消化系統非常脆弱,故極易患胃腸疾病[5]。斷奶兔腹瀉率和死亡率的升高給養兔業帶來了嚴重的經濟損失。本試驗擬研究復方中草藥作為飼料添加劑對兔生長性能以及免疫功能、腸道消化酶活性、抗氧化能力、腸道形態和腸道微生物的影響,為中草藥作為替抗添加劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 本試驗在浙江省農業科學院實驗動物養殖中心進行,試驗開始前對兔籠進行高溫消毒,選取72只體重相近的5周齡健康新西蘭大白兔,預飼養7 d后進行試驗。試驗全程所有兔按分組籠養,自由采食和飲水,每日清理糞便。

1.2 主要試劑和儀器 復方中草藥,購自北京生泰爾公司。氯化鈉、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀等試劑,均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;血清生化和免疫指標檢測試劑盒,均購自上海酶聯生物科技有限公司;小腸黏膜消化酶和抗氧化酶檢測試劑盒,均購自南京建成生物工程研究所;文庫制備試劑盒,購自紐英倫生物技術公司。電子天平和電子秤,均購自德國賽多利斯集團;高速冷凍離心機,購自賽默飛世爾科技有限公司;光柵式多功能酶標儀,購自上海美谷分子儀器有限公司;GS200自動生化分析儀,購自杭州Genius電子公司。

1.3 動物分組和處理 將72只大白兔隨機分成對照組(Control,CN)和中草藥組(Chinese herbal medicine,CM),每組36只,每組4個重復,每個重復9只,試驗期為42 d。根據初篩的試驗結果選擇合適的中草藥劑量。CN組飼喂基礎飼糧,基礎日糧組成和營養水平如表1所示;CM組飼喂混有600 mg/kg復方中草藥的基礎飼糧,復方中草藥的主要活性成分包含黃芪多糖(Astragaluspolysaccharide)、山茱萸(Cornusofficinalis)、杜仲葉提取物(Eucommiaulmoidesleaf extract)、白頭翁(Cynanchumauriculatum)和黃柏(Phellodendroncortex)。

表1 基礎飼糧組成和營養水平Table 1 Composition and nutrient level of basic diet

1.4 樣品采集 試驗第21、42天,從各組中隨機選擇4只健康兔,通過兔耳動脈采血收集血樣,用于血清生化和免疫指標檢測。試驗結束后(第42天),將兔頸椎脫臼處死,從十二指腸到回腸(十二指腸、空腸和回腸)分別剪取3 cm的腸段和5 cm的腸段各2份,2份3 cm腸段經生理鹽水洗滌后保存于-80 ℃,用于腸道消化酶和抗氧化酶檢測;1份5 cm腸段置4%多聚甲醛固定,用于絨毛形態評估;另1份5 cm腸段用于收集黏膜樣品,保存于-20 ℃,用于分析腸黏膜緊密連接蛋白的mRNA相對表達量。用無菌管采集盲腸內容物,儲存在-80 ℃,用于微生物多樣性分析。

1.5 檢測指標和方法

1.5.1 生長性能 每周測定各組兔的采食量和體增重,計算平均日采食量(Average daily feed intake,ADFI)和平均日增重(Average daily gain,ADG),根據公式(1)計算料重比(Feed-to-gain ratio,F/G)。

料重比=平均日采食量(g/d)÷平均日增重(g/d)

(1)

1.5.2 血清生化和免疫指標 試驗第21、42 天通過兔耳動脈采集5 mL血液樣品,將血樣于4 ℃、3 000×g離心10 min,收集血清。血清樣品送至杭州師范大學附屬醫院,測定生化指標,包括總膽固醇(Total cholesterol,Tchol)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)和甘油三酯(Triglyceride,TG)。采用酶聯免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測定血清中免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)和免疫球蛋白M(Immunoglobulin M,IgM),以及腸道黏膜中分泌型免疫球蛋白A(Secretory immunoglobulin A,sIgA)水平,均按試劑盒說明書進行操作。

1.5.3 小腸黏膜消化酶和抗氧化指標 采用ELISA測定小腸黏膜中α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性;測定小腸黏膜抗氧化指數,包括谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量。

1.5.4 小腸絨毛形態 將于4%多聚甲醛溶液中固定超過24 h的小腸組織樣品切成約1 cm的小塊包埋切片,進行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色。通過光學顯微鏡觀察小腸絨毛長度(Villus length,V)和隱窩深度(Crypt depth,C),每個切片隨機選擇至少5個絨毛和隱窩,采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析程序(Image-Pro Plus 6.0 Media Cyber netics,美國)測量數據后取平均值,計算絨毛長度與隱窩深度比值(V/C)。

1.5.5 腸黏膜緊密連接蛋白mRNA相對表達量 取50 mg小腸樣品加入1 mL裂解液,勻漿后于3 000×g離心10 min,取450 μL上清液,提取總RNA。通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000 軟件(Thermo Scientific,美國)評估RNA的完整性和純度。采用實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)檢測膜周蛋白(Zonula occludens-1,ZO-1)、閉鎖蛋白(Occludin)和閉合蛋白(Claudin)基因的表達,反應體系(20 μL):2×TransStart?Tip Green qPCR SuperMix 10 μL,TransStart?II One-step RT Enzyme Mix 0.4 μL,Passive Reference Dye 0.4 μL,上、下游引物各0.4 μL,RNA模板1.6 μL,無RNA酶水補足。PCR循環條件設置:50 ℃初始變性5 min;94 ℃變性30 s,94 ℃擴增5 s,60 ℃擴增34 s,進行40個循環。所有樣本進行3次重復。反應完成后,通過熔解曲線分析qRT-PCR產物的純度。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內參基因,使用2-ΔΔCt方法分析基因的mRNA相對表達量[6]。所有檢測基因及其引物信息見表2。

表2 緊密連接蛋白基因的qRT-PCR引物信息Table 2 Primer details for tight junction protein genes

1.5.6 高通量測序分析盲腸微生物多樣性 從盲腸內容物樣品中提取總基因組DNA,使用特異性引物(F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴增標準細菌16S rRNA基因的V3～V4區域,使用凝膠提取試劑盒純化PCR產物。使用TruSeq Nano DNA LT文庫制備試劑盒制備文庫,在Illumina MiSeq平臺(Illumina Technologies,美國)進行相關測序。過濾后高質量的序列都以97%的相似性水平聚類成操作分類單位(Operational taxonomic unit,OTU),在QIIME2軟件中使用Naive Bayes分類器對代表性序列進行注釋。通過α多樣性指數(包括Chaol指數、Shannon指數和Pielou-e指數)評估腸道微生物多樣性。

1.5.7 數據分析 試驗數據使用SPSS 19.0軟件進行統計,通過單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差異(Least significant difference,LSD)進行兩兩比較。所有數據均表示為“平均值±標準差(Mean±SD)”,P<0.05判定為具有顯著性差異,P<0.01判定為具有極顯著性差異意義。使用GraphPad Prism 8.0制圖。

2 結果

2.1 復方中草藥對兔生長性能的影響 由表3可知,與對照組相比,中草藥組兔的末重、ADG和ADFI有增加趨勢,且F/G降低,但差異均不顯著(P>0.05)。結果表明,基礎飼糧中添加復方中草藥對兔的生長性能無顯著影響。

表3 復方中草藥對兔生長性能的影響Table 3 Effects of compound Chinese herbal medicine on growth performance of rabbits

2.2 復方中草藥對兔血清生化指標的影響 由圖1可知,在試驗第21、42天時,基礎飼糧添加復方中草藥對兔血清中HDL、LDL和TG含量的影響均不顯著(P>0.05);與對照組相比,中草藥組兔血清中Tchol含量在試驗第21天時極顯著降低(P<0.01),在試驗第42天時差異不顯著(P>0.05)。

圖1 復方中草藥對兔血清生化指標的影響Fig.1 Effects of compound Chinese herbal medicine on serum biochemical indicators of rabbitsA:高密度脂蛋白含量; B:低密度脂蛋白含量; C:甘油三酯含量; D:總膽固醇含量M:試驗中期,即第21天; L:試驗末期,即第42天; 與對照組相比,*:P<0.05,**:P<0.01; 下同A:High density lipoprotein content; B:Low density lipoprotein content; C:Triglyceride content; D:Total cholesterol contentM:Mid-trial,day 21; L:End-trial,day 42; Compared with the CN group, *:P<0.05,**:P<0.01. The same as below

2.3 復方中草藥對兔免疫指標的影響 由圖2可見,與對照組相比,中草藥組兔血清中IgG含量在試驗第21、42天時均無顯著變化(P>0.05),血清中IgM含量在試驗第42天時顯著提高(P<0.05)。試驗結束(即第42天),與對照組相比,中草藥組兔回腸中sIgA含量顯著升高(P<0.05),十二指腸和空腸中sIgA含量變化不顯著(P<0.05)。

圖2 復方中草藥對兔免疫指標的影響Fig.2 Effects of compound Chinese herbal medicine on immune indicators of rabbitsA:血清中免疫球蛋白G含量; B:血清中免疫球蛋白M含量; C:十二指腸、空腸和回腸的腸道黏膜中分泌型免疫球蛋白A含量A:IgG content in serum; B:IgM content in serum; C:sIgA content in the intestinal mucosa of duodenum,jejunum and ileum

2.4 復方中草藥對兔小腸黏膜消化酶活性影響 由圖3可見,與對照組相比,中草藥組兔空腸中α-淀粉酶活性、十二指腸中糜蛋白酶活性和回腸中胰蛋白酶活性均顯著升高(P<0.05)。

圖3 復方中草藥對兔小腸黏膜消化酶活性的影響Fig.3 Effects of compound Chinese herbal medicine on intestinal digestive enzyme activities of rabbitsA:α-淀粉酶活性; B:糜蛋白酶活性; C:胰蛋白酶活性A:α-amylase activity; B:Chymotrypsin activity; C:Trypsin activity

2.5 復方中草藥對兔小腸黏膜抗氧化指標的影響 由圖4可見,與對照組相比,中草藥組兔空腸中SOD活性顯著升高(P<0.05),十二指腸和空腸中MDA含量顯著降低(P<0.05),空腸中GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)。

圖4 復方中草藥對兔小腸黏膜抗氧化指標的影響Fig.4 Effects of compound Chinese herbal medicine on intestinal mucosal antioxidant indicators of rabbitsA:超氧化物歧化酶活性; B:丙二醛含量; C:谷胱甘肽過氧化物酶活性A:Superoxide dismutase activity; B:Malondialdehyde content; C:Glutathione oxidase activity

2.6 復方中草藥對兔小腸絨毛形態的影響 由圖5A～5C可見,與對照組相比,中草藥組兔空腸的絨毛長度顯著增長(P<0.05),隱窩深度顯著降低(P<0.05),絨毛長度與隱窩深度比值極顯著升高(P<0.01)。由圖5D小腸H.E.染色觀察可見,對照組兔小腸絨毛出現了明顯的斷裂和一定程度的損傷,絨毛密度較低;而中草藥組兔小腸絨毛生長狀態良好,數量較多,密度較大,完整性較好。

圖5 復方中草藥對兔小腸絨毛形態的影響Fig.5 Effects of compound Chinese herbal medicine on intestinal villi morphology of rabbitsA:絨毛長度; B:隱窩深度; C:絨毛長度與隱窩深度比值; D:小腸形態H.E.染色觀察(40×)A:Villus length; B:Crypt depth; C:Villus length to crypt depth ratio; D:H.E. staining observatioin of small intestine morphology (40×)

2.7 復方中草藥對兔腸黏膜緊密連接蛋白mRNA相對表達量的影響 如圖6所示,與對照組相比,中草藥組兔十二指腸中ZO-1和ClaudinmRNA相對表達量沒有顯著變化(P>0.05),OccludinmRNA相對表達量顯著上調(P<0.05);空腸中ZO-1、Claudin和OccludinmRNA相對表達量沒有顯著變化(P>0.05);回腸中ZO-1和OccludinmRNA相對表達量顯著升高(P<0.05),ClaudinmRNA相對表達量無顯著變化(P>0.05)。

圖6 復方中草藥對兔腸黏膜緊密連接蛋白mRNA相對表達量的影響Fig. 6 Effects of compound Chinese herbal medicine on the mRNA relative expression of tight junction protein in rabbit intestinal mucosaA:十二指腸; B:空腸; C:回腸A:Duodenum; B:Jejunum; C:Ileum

2.8 復方中草藥對兔盲腸微生物多樣性的影響 通過Chaol、Shanon和Pielou-e指數分析盲腸微生物的多樣性和均勻性,結果如圖7A所示,與對照組相比,中草藥組兔盲腸內容物細菌16S rRNA基因的Chaol豐度值顯著升高(P<0.05),Shanon和Pielou-e指數呈增加趨勢,但差異不顯著(P>0.05)。兔盲腸內容物屬水平下的菌群分類如圖7B所示,中草藥組兔盲腸中的優勢菌群為梭菌屬(Clostridiales)、顫螺菌屬(Oscillospira)、疣微菌屬(Ruminococcaceae)、阿克曼菌屬(Akkermansia)、考拉菌屬(Phascolarctobacterium)、擬桿菌屬(Bacteroidales)、毛螺菌屬(Lachnospiraceae)、糞球菌屬(Coprococcus)、類桿菌屬(Bacteroidetes)和腸球菌屬(Enterococcus),其中Clostridiales和Akkermansia占比較對照組顯著升高(P<0.05)。

圖7 復方中草藥對兔盲腸微生物多樣性的影響Fig.7 Effects of compound Chinese herbal medicine on cecal microbial diversity of rabbitsA:盲腸微生物的多樣性和均勻性分析; B:盲腸微生物的菌群分類A:Diversity and homogeneity analysis of cecal microbiota; B:Classification of cecal microbial flora

3 討論

隨著畜牧行業的快速發展,飼料添加劑和抗生素抗性等問題備受關注。中草藥有促進消化酶分泌、提高免疫力和增強食欲等作用,被認為是理想的飼料添加劑[7]。有研究表明,黃芪多糖可以改善動物腸道健康,提高免疫力,從而提高動物的生長性能[8]。本試驗結果顯示,補充復方中草藥對兔子的ADG、ADFI和F/G沒有顯著影響,這與Liu等[9]的試驗結果相同,飼糧中添加艾蒿對兔的生長性能沒有影響;Zhang等[10]在肉雞上應用復方中草藥也得到同樣的結果。但Yeh等[11]報道顯示,飼糧中添加中草藥可增加仔豬的ADFI。這些結果表明,中草藥對生長性能的影響可能與動物種類、生長周期和中草藥使用劑量等有關。

血脂可以反映機體脂類代謝水平,血脂過高與糖尿病、中風、心梗死和脂肪肝等一系列疾病密切相關[12],臨床上通過測定HDL、LDL、TG和Tchol等指標來判斷體內血脂水平[13]。趙香菊等[14]研究顯示,中藥水蛭超微粉可降低大耳白兔的血脂。本試驗結果顯示,飼糧中添加中草藥可顯著降低兔體內Tchol含量,故推測中草藥有降低血脂的作用。

血清免疫球蛋白(IgG和IgM)和腸道分泌型免疫球蛋白(sIgA)作為評價動物免疫力的指標,對動物機體健康起著重要作用。王婧等[15]研究顯示,在飼料中添加杜仲、黃芪、黨參、山楂和魚腥草等常見的中草藥,可以顯著提高斷奶仔豬血清中 IgG、IgM和IgA抗體含量。在本試驗中,中草藥組兔血清中IgM含量顯著提高,但IgG含量的變化不顯著,這可能與中草藥配方有關。sIgA作為腸黏膜的主要免疫球蛋白,是腸黏膜的第一道防御線,能抵御各種內源性共生菌和外源性病原菌[16]。李姣清等[17]研究發現,飼料中添加復方中草藥制劑可使三黃雞回腸中sIgA分泌量增加30.95%。該結果與本試驗結果一致,中草藥組兔回腸黏膜中sIgA含量顯著增加,表明飼糧中添加該中草藥配方可有效增強兔腸道的免疫功能。

消化酶能夠直接影響營養物質的分解和吸收,從而影響動物的生長性能。淀粉和蛋白質主要由α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶等消化。本試驗發現,飼糧中添加中草藥顯著提高了腸道中α-淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性,說明中草藥能刺激消化酶的分泌,從而加強對淀粉和蛋白質等營養物質的消化吸收,提高養分利用率,最終提高飼料利用率。動物腸道上皮細胞經常暴露于氧化應激環境中,例如致病菌、攝入的藥物、細菌代謝的產物和代謝過程中產生的氧化劑等,這些物質產生的活性氧會導致腸道上皮細胞的氧化損傷。體內活性氧自由基發生變化,會引起機體的生理和病理性反應,從而導致氧化應激[18]。抗氧化酶可以保護機體免受氧化損傷并增強防御能力。GSH-Px和SOD可去除過氧化物和羥基自由基,保護細胞膜的結構和功能[19-20]。MDA是檢測脂質過氧化最常用的指標之一。王佳敏等[21]研究顯示,飼料中添加黃芪復方顆粒可顯著增加SOD活性,降低MDA含量。與本試驗結果一致,中草藥組兔空腸中SOD活性顯著提高,十二指腸和空腸中MDA含量顯著降低,表明該中草藥配方能夠提高兔腸道的抗氧化能力,從而減輕兔斷奶應激,這可能與配方中黃芪的抗氧化作用有關[21]。

小腸是營養物質消化吸收的主要場所,小腸的形態(絨毛高度和隱窩深度)是衡量其消化吸收功能的主要指標。絨毛是小腸吸收營養物質的主要部位,隱窩深度的變化能夠反映腸上皮細胞的增殖和發育情況[22]。有研究表明,添加復方中草藥可使仔豬回腸的絨毛高度增加,隱窩深度顯著降低[23]。與本試驗結果一致,中草藥組兔小腸絨毛長度顯著增長,隱窩深度顯著降低,絨毛長度與隱窩深度比值顯著升高,表明添加中草藥后腸道分泌功能提高,吸收能力增強。

緊密連接蛋白是上皮細胞之間的一種粘連復合物,與粘附連接、間隙連接和橋粒共同構成上皮細胞連接復合體,在細胞旁途徑發揮重要作用[22]。緊密連接蛋白是腸屏障的重要組成部分,ZO-1、Occludin和Claudin是細胞間緊密連接的重要蛋白分子,緊密連接蛋白與外界環境的相互作用可介導多個信號通路以改變跨上皮通透性,影響腸屏障的完整性,從而引起各種腸道疾病[23]。楊晉[24]研究顯示,飼糧中添加400 mg/kg海藻多糖可顯著上調仔豬空腸和回腸中緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1 mRNA表達量。本試驗結果顯示,中藥組兔回腸中ZO-1和OccludinmRNA相對表達量顯著高于對照組。研究表明,Occludin和ZO-1基因的上調可減輕局部炎癥,改善腸道屏障通透性[25]。

動物腸道微生物菌群組成與其居住的生活環境、攝入的營養物質和自身的基因組等相關,菌群積極參與宿主營養代謝、免疫防御和信號傳導等。盲腸微生物菌群的數量和密度可影響動物機體對營養物質的消化吸收和腸道健康[26]。本試驗結果顯示,中草藥組兔盲腸內容物微生物基因的Chaol豐度值顯著高于對照組,說明添加該中草藥配方可以提高兔盲腸微生物多樣性;在屬水平分類下,中草藥組兔盲腸中優勢菌群為Clostridiales、Oscillospira、Ruminococcaceae和Akkermansia等。Clostridiales和Oscillospira是厚壁菌門的成員,它們是嚴格厭氧菌,能夠發酵碳水化合物,為宿主提供營養[27]。Akkermansia屬于疣微菌門,可改善腸道屏障的完整性[28]。

綜上所述,在基礎飼糧中添加該復方中草藥飼料添加劑對兔的生長性能影響不顯著,但可以顯著提高兔的腸道消化酶活性和抗氧化能力,增強機體免疫功能,降低血脂,維持腸道形態的完整性以及盲腸內容物微生物的多樣性。