牛副結核病的病原學和防控研究進展

劉蒙達,張皓博,亓 菲,沈葉盛,2,蘇華彬,3,張 力,李 巖,孫淑芳,樊曉旭

(1.中國動物衛生與流行病學中心人畜共患病監測室,山東 青島 266032 ; 2. 山東農業大學動物科技學院,山東 泰安 271018 ; 3. 青島農業大學動物醫學院,山東 青島 266109 ; 4. 新疆生產建設兵團 畜牧獸醫工作總站,新疆 塔城 832104)

牛副結核病(Bovine paratuberculosis)是一種由禽分枝桿菌亞種——副結核分枝桿菌(Mycobacteriumaviumsubspeciesparatuberculosis,MAP)引起的,主要影響反芻動物的慢性消耗性疾病。副結核病又稱副結核性腸炎或約內氏病(Johne's disease),在實際臨床中主要表現為腸炎、頑固性腹瀉和漸進性消瘦等,腸黏膜增厚呈現腦回樣變是其主要的病理變化[1]。在2022年6月29日我國農業農村部新發布的《一、二、三類動物疫病病種名錄》中,雖然已將牛副結核病降為三類動物疫病[2],但該病所造成的經濟損失和公共衛生影響仍然不可忽視。牛副結核病是影響全球奶牛業最嚴重的傳染病之一,可造成產奶量減少、體重降低、撲殺/死亡和疾病控制成本增加等[3]。該病還是一種潛在的人獸共患病,人類食用被副結核分枝桿菌污染的牛奶或奶制品可造成過敏性腸道癥狀和潰瘍性腸炎,即克羅恩病(Crohn's disease)。副結核分枝桿菌感染人類不一定會導致發病,但它可能是克羅恩病和其他疾病(比如1型糖尿病和多發性硬化癥)的誘因之一[4]。牛副結核病難以診斷,病原分離周期長,且非結核分枝桿菌的組成復雜,我國相關研究報道較少且存在誤區。本文旨在提煉性的闡述牛副結核病的病原學、流行病學、臨床癥狀、診斷和防控策略等信息,以期為該病的預防和控制工作提供參考。

1 副結核病的發現

分枝桿菌對人類社會的影響有著相當長的歷史。在公元前8 000年的骨骼化石中,科學家發現了由分枝桿菌感染引起的脊柱病變;肺部病變甚至可追溯到公元前1 000年[5]。1826年,Hurtrel Arboval發現患病牛出現與慢性腹瀉有關的大腸和小腸黏膜增厚,這可能是有文獻記載的人類最早發現的副結核病;1894年,Heinrich Albert Johne博士和Langdon Frothingham博士對1頭生產性能不佳的奶牛進行剖檢時,發現其腸黏膜增厚、腸系膜淋巴結腫大,炎癥組織內有大量抗酸細胞浸潤;研究認為該病病原是一種導致鳥類結核病的細菌(后來被稱為“禽結核分枝桿菌”),并于1895年公開報道該病為“偽結核性腸炎”;直到1951年,英國科學家Frederick William Twort才從被枯草芽孢桿菌污染的培養基上偶然分離到副結核分枝桿菌[1]。

2 牛副結核病的病原學

副結核分枝桿菌屬于禽分枝桿菌復合群,專性細胞內寄生,是一種桿狀、革蘭染色呈陽性的抗酸菌,其蠟質細胞壁由阿拉伯半乳聚糖連接的霉菌酸鹽和肽聚糖層組成,對環境有很強的抵抗力[6]。有報道稱,在不受陽光照射的干燥環境中,該菌存活時間長達55周[7];而在光照情況下,其存活時間可能會縮短到1周[8]。該菌寄生在宿主體內時,其細胞壁通常消失,從而對多種作用于肽聚糖的抗生素(如青霉素、頭孢菌素和萬古霉素)產生耐藥性[9]。

由于副結核分枝桿菌無法產生分枝桿菌素(一種鐵螯合化合物),影響了細胞膜對鐵的轉運,所以該菌的繁殖速度很慢,倍增時間一般為22～26 h[10]。該菌進行體外培養時,可選擇羅氏固體培養基,于37 ℃恒溫培養箱中生長,一般2～4周可見灰白色的結節狀菌群。

根據生長特征、菌落色素沉著和宿主關聯,可以將副結核分枝桿菌分成3個菌株組:綿羊型又稱“S 型”(在自然條件下可感染羊,對牛也有輕微感染能力);牛型又稱“C 型”(在自然條件下只感染牛,而不使羊發病);野牛型又稱“B 型”;近期也有“駱駝型”的相關報道[6]。目前,我國已在奶牛中分離到“S型”和“C型”菌株,且“C型”為主要流行菌株[11]。根據IS900限制性片段長度多態性,可將該菌分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型(表1)。Ⅰ型主要分離自綿羊;Ⅱ型宿主較為廣泛,在牛和多種動物以及人類均有分離的報道;Ⅲ型為“生物中間型”,是“S 型”的1個亞型[6]。

表1 副結核分枝桿菌的分型及其主要宿主Table 1 Types and main hosts of MAP

2.1 副結核分枝桿菌的致病機理 副結核分枝桿菌主要通過糞—口傳播途徑在牛中傳播,其中犢牛最易感[12]。引入亞臨床感染的動物被認為是造成畜群間傳播的主要原因[13]。被感染的動物通過糞便和乳汁持續排菌。當動物經口暴露后,病原菌進入動物體內,首先定植在回腸和空腸的派爾集合淋巴結(Peyer's patch),然后擴散到腸道黏膜固有層[14]。幼年動物由于短暫性的派爾集合淋巴結細胞增加,表示出更強的易感性[15]。即使沒有派爾集合淋巴結,副結核分枝桿菌仍然可以穿過上皮細胞到達腸壁細胞[16]。該菌可以抵抗活性氧中間體的作用,避免被降解[17]。當副結核分枝桿菌被樹突狀細胞和巨噬細胞吞噬后,可避免細胞凋亡、逃避溶酶體的吞噬,通過改變趨化因子和細胞因子信號傳導來逃避識別,并抑制樹突狀細胞的分化成熟[15]。最終,病原菌隨病畜糞便一同排出腸道,這也正是該菌通過糞—口傳播途徑持續排毒的原因[18]。在副結核發病牛的糞便(圖1A)和腸系膜淋巴結(圖1B)均可發現副結核分枝桿菌[19]。

圖1 副結核分枝桿菌的鏡檢觀察(萋尼染色,1 000×)[19]Fig.1 Microscopic observation of MAP (Zeni-Neelsen staining,1 000×)[19]A:糞便樣品; B:腸系膜淋巴結樣品A:Fece samples; B:Mesenteric lymph node samples

2.2 副結核分枝桿菌的毒力 引起副結核分枝桿菌對巨噬細胞侵入、定殖,以及疾病發展的毒力機制仍然難以確定。基于對分枝桿菌的研究,幾種潛在相關因子被認為可能與宿主細胞相互作用,影響該菌的毒力和致病機理(表2)[17]。有研究通過改變特定基因,觀察細菌毒力的變化,并在宿主體外確定了主要毒力因子的作用(表3)[17]。

表2 可能與副結核分枝桿菌毒力相關的潛在因子及其作用[17]Table 2 Potential factors and their functions that may be related to MAP virulence[17]

表3 副結核分枝桿菌的主要毒力因子及其作用Table 3 Main virulence factors and their functions of MAP

3 牛副結核病的流行病學

牛副結核病在全球范圍內廣泛流行,且對全球養牛業造成巨大的經濟損失。據估算,集約化養殖的國家,奶牛副結核病的場群陽性率超過50%[20]。基于ELISA檢測、細菌分離培養和PCR檢測,美國的奶牛場群陽性率介于68%～91%,肉牛場群陽性率為8%[21];每頭奶牛每年由該病造成的損失為21～79美元[21]。在英國,該病的感染率介于15%～33%,每年由該病造成的損失超過200萬英鎊,是導致奶牛淘汰的主要傳染病之一[22]。

我國關于牛副結核病流行病學調查的研究較為有限。1955年,我國內蒙古自治區確診首例牛副結核病病例,隨后多個省份報道了確診病例[22]。對2014年于北京7個奶牛場采集的8 549份血清樣品進行ELISA檢測,抗體陽性率為9.25%[23]。犢牛對副結核分枝桿菌的感染幾乎沒有體液免疫[12]。北京的調查研究也表明,2歲齡以下的犢牛血清樣品抗體陽性率非常低;而2歲齡以上的血清樣品抗體陽性率超過14%[23]。2018—2020年的一項研究顯示,在大連市連續3年用ELISA方法檢測奶牛血清中副結核分枝桿菌的抗體,陽性率呈現從8%降至2%再升到8%的波動趨勢[24],分析原因可能與防控措施有關,也可能與2019年所檢測樣品以犢牛為主有關。2020年,對甘肅省227份奶牛血清進行副結核分枝桿菌抗體ELISA檢測,結果顯示,抗體陽性率為5.73%[11]。牛副結核病的傳播速度緩慢,不同病例的出現往往間隔較長時間,部分研究認為該病呈現散發性,實際上該病是一種緩慢傳播的地方流行性傳染病[22]。

4 牛副結核病的臨床癥狀

動物一旦感染副結核分枝桿菌,通常會有數年的無癥狀潛伏期[25]。同時,大量細胞外副結核分枝桿菌在血液中循環,刺激適應性免疫系統,引起機體產生特異性免疫應答[26]。當該菌成功定殖于腸道中時,機體便會出現特征性的肉芽腫、組織學和表觀的病變,影響動物的營養吸收,導致病畜營養不良、漸進性消瘦,嚴重時造成病畜死亡(圖2A)[19,27],剖檢可見病牛回腸黏膜腫脹出血,有黏液膿性分泌物(圖2B),腸系膜淋巴結可見明顯的髓樣腫脹(圖2C)[19]。副結核病晚期的特征性跡象是嚴重腹瀉和骨骼的表觀病變[28]。

圖2 副結核分枝桿菌感染牛的眼觀病變[19]Fig.2 Gross lesions in cattle infected by MAP[19]A:病牛消瘦; B:回腸黏膜; C:腸系膜淋巴結A:Emaciated cattle; B:Ileal mucosa; C:Mesenteric lymph nodes

5 牛副結核病的診斷

感染副結核分枝桿菌的動物會出現細胞免疫和體液免疫分離的現象,細胞免疫隨病情康復而增強,體液免疫隨病情加重而增強[29]。在不同感染階段,患病動物表現不同的病理、生理和免疫狀態,加之長達數年的潛伏期和亞臨床癥狀,給副結核病的診斷造成了很大的困難。

5.1 細菌分離培養 副結核分枝桿菌的分離培養具有高度特異性,被世界動物衛生組織(World Organization for Animal Health,WOAH)視為診斷副結核病的參考標準[22]。有多種培養基可供選擇,包括L?wenstein-Jensen培養基、Herrold's卵黃培養基、Middlebrook 7H9、7H10和 7H11[17],一般常用含分枝桿菌生長素的Heirold's卵黃培養基。但是,動物在感染初期和漫長的潛伏期很少排菌,糞便采樣很難成功分離培養該菌,而且該菌生長緩慢,通常需要培養2～4周,可能會錯過最佳的診斷和淘汰期,造成疫病的傳播。

5.2 染色鏡檢 副結核分枝桿菌細胞壁中含有大量糖脂,通常采用萋尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法進行染色[30]。該菌在顯微鏡下呈紅色球桿狀,成叢或成團存在,背景為藍色。細菌染色鏡檢要求待檢樣品中含有一定的帶菌量。該方法檢測速度快、成本低,結果直觀。但是該方法敏感性較低,難以檢測到低濃度的細菌;而且它的特異性有限,無法區分其他抗酸桿菌。

5.3 分子生物學方法 副結核分枝桿菌的實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)檢測方法可參照國家標準(GB/T27637—2011),針對其特異性F57基因序列進行擴增檢測。qPCR檢測方法已經廣泛應用對血液、牛奶、糞便和環境樣品進行副結核分枝桿菌感染的診斷,該方法具有快速、靈敏的特點。有研究根據副結核分枝桿菌的特異片段IS900,設計了1對可用于分離菌株鑒定的引物[31]。需要注意的是,因為部分環境微生物基因組也能擴增出與預期大小相同或相近的片段,所以直接采用qPCR方法對待檢樣品進行檢測可能會出現假陽性[32]。

5.4 抗體檢測 目前,商品化的ELISA試劑盒主要用于檢測牛奶或牛血清中的副結核分枝桿菌抗體。據報道,其檢測特異性可達98%(臨床疾病)[33]。相比細菌分離培養、PCR或qPCR,ELISA方法的成本低、工作周期短、方法標準化,適合大量樣品的檢測。但是,抗體檢測的準確性與采樣時間、動物病程和機體狀態有關,ELISA檢測需要病畜已進入體液免疫期,且因抗體水平不同,該方法的敏感度差異較大。澳大利亞的一項研究顯示,對2～6歲不同年齡的奶牛進行副結核病的血清抗體檢測,ELISA方法的敏感性介于1.2%～15%[33]。國內的一項研究發現,ELISA方法的敏感度不及PCR方法的一半[32]。但是,在副結核分枝桿菌感染晚期,ELISA方法的敏感性非常高[34]。

5.5 皮膚變態反應和γ干擾素釋放試驗 皮膚變態反應和γ干擾素釋放試驗等方法可用于副結核病的早期診斷,但是由于結核菌素具有高度特異性,易受其他結核桿菌的影響而造成假陽性[35]。因此,采用這2種方法較難準確判斷副結核分枝桿菌的感染。

綜上所述,在牛的不同生長階段中,育成階段牛副結核病的診斷最為困難。因為育成牛在長期的亞臨床階段,細胞免疫應答和體液免疫應答可能均不明顯,且排菌量較低,因缺少理想的檢測方法,可考慮采用皮膚變態反應和γ干擾素釋放試驗,結合抗體檢測和細菌分離培養的方法進行檢測[33]。2歲以上的患牛大都已進入體液免疫階段,此時病牛持續感染排菌,臨床上可采用ELISA和qPCR方法進行檢測。

6 牛副結核病的防控

人類研究牛副結核病的歷史已經超過百年,但是仍然沒有特效的治療和防控措施。當病畜進入感染晚期,臨床癥狀明顯,生產性能下降,抗體水平升高。雖然此時易于診斷,但是長期腹瀉可能已經造成副結核分枝桿菌的大量污染。因此,改善牛場環境衛生,尤其是避免犢牛的感染,結合檢測—剔除方法,是控制該病傳播的主要措施[21]。防止犢牛攝入含有副結核分枝桿菌的成年牛乳汁和糞便,可以有效降低該病的擴散[36]。由于副結核病可以通過胎盤屏障垂直傳播,所以已感染母畜的新生犢牛應當隔離飼養,最好及時進行檢測并淘汰[36]。在副結核病高度流行的地區,每年應對牛群進行3～4次檢測,及時淘汰陽性牛,避免造成更大的損失;對于疑似感染的牛,應嚴格隔離飼養,3個月后應再次檢測[13]。

為了降低撲殺和淘汰病畜造成的巨大損失,部分歐美國家對新生犢牛進行疫苗接種。英國和部分東歐國家使用減毒活疫苗,美國和挪威等國家使用滅活疫苗[37]。但是,由于犢牛對副結核分枝桿菌易感,并存在垂直傳播的風險,疫苗的保護效果受到質疑。同時,接種疫苗會影響臨床上對牛結核病的診斷[36]。所以利用疫苗控制副結核病的方法沒有在全球推廣。

7 總結與展望

牛副結核病給養殖業以及乳品和牛肉的生產都造成了巨大的損失。該病造成的經濟損失難以估算,其中不僅包括病牛淘汰的成本,還包括因飼料利用率低、生產性能差而導致的隱形損失和浪費的機會成本。對于副結核病感染早期的動物免疫機制的相關研究較少,對于該病的認識尚停留在淺層,且牛副結核病難以診斷,大量潛伏期的病畜可能無法確診,導致其流行率被低估。研究認為,即使最敏感的分子檢測技術也只能檢測到25%～30%的受感染動物。因此,亟需改進現有的診斷方法,特別是鑒別診斷方法。目前,對于牛副結核病缺乏有效的防治手段,良好的管理和及時的檢測成為最有效的防控措施。加強生物安全管理,有效實現控制凈化,研發快速準確的檢測方法,是防控牛副結核病的重要方向。