不同干燥方法對合歡花藥材化學成分及其抗氧化活性影響

左亞鋒,徐秀泉,李巧月,王孟虎,孟祥松*,閆 攀,金傳山,吳德玲*

1亳州學院中藥學院;2亳州學院 中藥原料產品研發安徽普通高校重點實驗室,亳州 236800;3安徽中醫藥大學藥學院,合肥 230012

合歡花為豆科植物合歡(AlbiziajulibrissinDurazz.)的干燥花序或花蕾,前者稱“合歡花”,后者稱“合歡米”,其性甘,平,歸心、肝經,具有解郁安神功效[1]。合歡花藥用歷史悠久,始載于《神農本草經》,歷代本草對其解郁安神之功效應用均有記載[2]。現代研究表明合歡花含有槲皮苷、槲皮素等大量黃酮類成分[3,4]和少量多糖、揮發油類等活性成分,具有抗抑郁、鎮靜催眠、抗焦慮、保肝和抗氧化等多種藥理作用[5]。

合歡花中含有大量黃酮苷類成分,苷類化合物易受酶的作用而水解,而含苷的中藥往往也含有可水解該苷的酶。干制是新鮮合歡花產地采摘后必需的初加工過程,不同的干燥初加工過程可能會激活或抑制酶的活性,導致活性物質在酶的作用下水解或保存,從而引起合歡花藥材品質的變化[6,7]。“殺青”是通過一定方法將采收后植物體內相關酶進行滅火的方法。“殺青”方法在中藥材初加工中應用廣泛,合適的“殺青”方法可以破壞新鮮植物體內酶活性,有利于保留活性物質,影響著藥材的性狀和品質[8]。合理的干制初加工方式對合歡花藥材中黃酮苷類成分的保留發揮重要作用,合歡花傳統的干燥方法為曬干[2],傳統曬干方法受自然環境影響較大,不同規格合歡花外觀形態差異較大,合歡花和合歡米通用曬干方式是否合適尚不明確。

因此本研究以合歡花和合歡米為研究對象,比較傳統干燥方法(曬干、陰干)、不同殺青干燥方法(蒸汽殺青后烘干、微波殺青后烘干)、烘干(30、50、70、90 ℃)和冷凍干燥方法對2種規格合歡花藥材中關鍵活性物質和抗氧化活性的影響,為合歡花類藥材的產地加工及利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司,配置SPD-M20A型紫外可見光檢測器);A01-10NA0848型冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司);UV-1900i紫外可見分光光度計(島津儀器(蘇州)有限公司);XPR2型1/100萬電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司),FA2104B分析天平(上海越平科學儀器有限公司);SpectraMax iD3型酶標儀(美谷分子儀器(上海)有限公司)。

1.2 材料與試劑

2,2-聯苯基-1-苦基肼基(DPPH)(上海源葉生物科技有限公司,批號:B25609-20 mg);2,2′-聯氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)(上海源葉生物科技有限公司,批號:S19198-5 g);1,10-菲洛啉(上海源葉生物科技有限公司,批號:S19172-25 g);鄰苯三酚(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,P104235-100 g);異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素對照品(成都普菲德生物技術有限公司,批號分別為MUST-21041613、MUST-21080502、MUST-2203310,純度均≥98%);乙腈、甲醇為色譜純,其他試劑均為分析純。

合歡花采摘于安徽省亳州市亳州學院校園內,經安徽中醫藥大學金傳山教授鑒定為豆科植物合歡AlbiziajulibrissinDurazz.的新鮮花序及花蕾。將新鮮合歡花和合歡米通過曬干(D1)、陰干(D2)、蒸汽殺青后烘干(D3)、微波殺青后烘干(D4)、30 ℃烘干(D5)、50 ℃烘干(D6)、70 ℃烘干(D7)、90 ℃烘干(D8)、冷凍干燥(D9)九種干燥方法進行干燥,干燥后樣品置于置通風干燥處保存備用。

1.3 方法

1.3.1 合歡花藥材的干燥處理

摘取新鮮合歡花藥材,按照外觀形態分為花蕾型(合歡米AlbiziajulibrissinDurazz.flower bud,AJFB)和盛開型(合歡花AlbiziajulibrissinDurazz.flower,AJF)2種規格(見圖1)。取新鮮合歡花樣品,均勻分成9份。取新鮮合歡花于干凈托盤中,放置于陽光下干燥得到曬干樣品;取新鮮合歡花于干凈托盤中,放置于房間陰涼處通風干燥,及時翻動,得到陰干樣品;取新鮮合歡花于冷凍干燥機中進行冷凍干燥得到冷凍干燥樣品;取新鮮合歡花于蒸汽鍋中殺青4 min,取出置干凈托盤中,然后在50 ℃烘箱中烘干得到蒸汽殺青后烘干樣品;取新鮮合歡花于微波爐(700 W)中殺青4 min,取出置干凈托盤中,然后在50 ℃烘箱中烘干得到微波殺青后烘干樣品;取新鮮合歡花于干凈托盤中,分別于30、50、70、90 ℃烘箱中干燥得到30、50、70、90 ℃烘干樣品;取新鮮合歡米樣品,均勻分成9份,按照上述合歡花樣品方法干燥,樣品均需干燥至含水量≤15%[1]。將干燥后樣品粉碎過三號篩(50目,355±13 μm),放干燥器中密封保存備用。

圖1 不同規格合歡花藥材

1.3.2 總黃酮含量測定

參照文獻總黃酮含量測定方法[9]測定樣品中總黃酮含量。

1.3.3 槲皮苷、槲皮素、異槲皮苷含量測定

1.3.3.1 對照品溶液的制備

分別精密稱定槲皮苷對照品10.05 mg、異槲皮苷對照品6.02 mg、槲皮素對照品6.03 mg置于10 mL的容量瓶中,加甲醇溶解至刻度,定容,配成質量濃度分別為1.005、0.602、0.603 mg/mL的混合對照品溶液。

1.3.3.2 供試品溶液的制備

精密稱取合歡花粉末(過三號篩)約2.0 g,放置于具塞錐形瓶中,然后加甲醇40 mL溶解并稱定質量,超聲處理40 min(40 kHz、300 W)取出放冷至室溫后,用甲醇補足失重。先搖勻然后用濾紙濾去殘渣,取上清液10 mL置于蒸發皿中,水浴(50 ℃)濃縮,加90%甲醇使溶解并定容至100 mL容量瓶中,用0.22 μm微孔濾膜濾過,即得供試品溶液[10]。

1.3.3.3 色譜條件

Welch Ultimate Polar RP色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);甲醇(A)～0.1%磷酸水溶液(B)進行梯度洗脫(0～5 min,60%A;5～10 min,50%A→45%A;10～20 min,45%A→40%A;20～30 min,40%A→35%A;30～40 min,35%A→90%A;40～45 min,90%A→60%A;45～55 min,60%A)[11];檢測波長為360 nm;流速1 min/mL;柱溫為35 ℃;進樣量為10 μL,合歡花藥材樣品溶液和混合對照品溶液HPLC色譜圖(見圖2)。

圖2 混合對照品溶液(A)和樣品溶液(B)的HPLC色譜圖

1.3.3.4 方法學考察

精密吸取“1.3.3.1”項下混合對照品工作液,按“1.3.3.3”項下色譜條件測定,以峰面積為縱坐標,質量濃度為橫坐標,進行線性回歸得回歸方程(見表1)。

表1 3種黃酮類成分的線性關系

精密吸取“1.3.3.1”項下混合對照品工作液,連續進樣6次,計算異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素峰面積的RSD分別為0.35%、0.030%、0.050%,表明儀器精密度良好。

取曬干合歡花樣品供試品溶液,按“1.3.3.3”項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定,計算異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素峰面積的RSD分別為1.7%、0.14%、1.8%,表明在24 h內供試品溶液穩定性良好。

精密稱取曬干合歡花樣品粉末6份,按照“1.3.3.2”項下方法制備供試品溶液,按照“1.3.3.3”項下色譜條件進樣測定。計算異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素峰面積的RSD分別為2.3%、0.56%、1.1%,表明該方法的重復性良好。

取已知含量的曬干合歡花樣品(每1 g樣品中含異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素的量分別為1.75、16.45、0.145 mg)粉末6份,每份約1.0 g,精密稱定,分別加入混合對照品溶液(每1 mL分別含有異槲皮苷0.182 3 mg、槲皮苷1.638 5 mg和槲皮素15.20 μg)10 mL和甲醇溶液30 mL,按“1.3.3.2”項下方法制備供試品溶液,按“1.3.3.3”項下色譜條件測定,計算加樣回收率及RSD值,各成分異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素回收率分別為100.2%、100.0%、99.24%,RSD值分別為2.2%、0.29%、4.3%,表明方法較為準確可靠。

1.3.3.5 樣品含量測定

分別精密吸取不同干燥處理合歡花藥材樣品的供試品溶液,按“1.3.3.3”項下色譜條件測定異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素含量。

1.3.4 抗氧化活性測定

1.3.4.1 Fe3+還原能力測定

參考文獻方法測定樣品Fe3+還原能力[8]。取1 mL供試品溶液(生藥質量濃度為5 mg/mL)加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)和2.5 mL K3Fe(CN)6(1%,W/W)溶液中,50 ℃反應20 min。冷卻后,加入2.5 mL三氯乙酸(10%,W/V),離心(3 500 g)10 min。將上清液(2.5 mL)與蒸餾水(2.5 mL)和新鮮制備的FeCl3溶液(1 mL,0.1%,W/W)混合,取混合液200 μL置于96孔板中,在700 nm處立即記錄吸光度。按公式計算Fe3+還原能力:R=A1-A0,式中,R越大表明樣品的還原能力越強,A1為加入樣品后吸光度,A0為空白對照組吸光度。

1.3.4.2 DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除能力參考文獻測定[12-14]。取供試品溶液(生藥質量濃度為5 mg/mL)1 mL與3 mL DPPH(0.1 mmol/L)混合,將混合物搖勻,避光條件下室溫保存30 min,取混合液200 μL置于96孔板中,然后在517 nm處測定吸光度。DPPH自由基清除率計算公式:I=[1-(A2-A1)]/A0× 100%。式中,I表示清除率,A2為含空白溶劑的樣品溶液,A1為含自由基工作溶液的樣品溶液,A0為含有自由基工作溶液的空白溶劑。

1.3.4.3 ABTS自由基清除能力測定

ABTS自由基清除能力參考文獻測定[15,16]。將7 mL ABTS(7 mmol/L)與88 μL K2S2O8(140 mmol/L)混合,黑暗反應14～16 h,得到ABTS工作溶液。然后用乙醇稀釋,在734 nm處測得的吸光度為0.70±0.02。然后,取0.2 mL供試品溶液(生藥質量濃度為5 mg/mL)和8.8 mL ABTS工作溶液完全混合,在避光條件下室溫混合15 min。在734 nm處測定吸光度。ABTS自由基清除率計算公式:I=[1-(A2-A1)]/A0× 100%。式中,I表示清除率,A2為含空白溶劑的樣品溶液,A1為含自由基工作溶液的樣品溶液,A0為含有自由基工作溶液的空白溶劑。

1.3.4.5 總抗氧化能力測定

總抗氧化能力參照文獻測定[19,20],首先用1,10-菲洛啉法繪制FeSO4標準曲線,Y=1.329 7X-0.018 3(R2=0.999 5),然后精密移取系列稀釋100倍供試品溶液(生藥質量濃度為5 mg/mL)1 mL,0.2% FeCl3乙醇溶液1 mL,0.5% 1,10-菲洛啉乙醇溶液500 μL,置于10 mL容量瓶中定容至刻度,黑暗處反應放置20 min。以1 mL 95%的乙醇為空白對照,將樣品放置于96孔板中,然后在510 nm處測定吸光度。將測得的吸光度數值代入上述標準曲線方程,計算不同樣品Fe2+當量,Fe2+濃度越高,表明樣品具有越強的還原Fe3+為Fe2+的能力。

1.3.5 黃酮類成分與抗氧化活性相關性分析

將不同干燥處理合歡花藥材的各化學成分標準化值分別與抗氧化活性標準化值進行Spearman相關性分析。

1.3.6 數據統計

2 結果與分析

2.1 合歡花藥材黃酮類成分測定

2.1.1 總黃酮類成分含量測定

總黃酮在不同干燥的合歡花藥材樣品中的含量(見圖3)。曬干、陰干、蒸汽殺青后烘干、90 ℃烘干、冷凍干燥對合歡花中總黃酮含量影響有顯著差異(P<0.05),其中蒸汽殺青后烘干樣品總黃酮含量最高,微波殺青后干燥和70 ℃烘干、30 ℃烘干和50 ℃烘干對合歡花中總黃酮含量影響無顯著性差異,陰干的合歡花樣品中總黃酮含量最低。與曬干的合歡米樣品中總黃酮含量相比,其他干燥處理均顯著提高總黃酮含量(P<0.05),冷凍干燥處理的合歡米樣品中總黃酮含量最高。

圖3 不同干燥方法處理的2種規格合歡花藥材中總黃酮含量

2.1.2 異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素含量測定

為綜合評價合歡花藥材的品質,測定干燥樣品中異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素等成分的含量(見圖4)。蒸汽殺青后烘干的合歡花樣品中異槲皮苷和槲皮苷含量最高,而槲皮素含量則較低。陰干的合歡花樣品中異槲皮苷、槲皮苷和槲皮素含量都顯著較低(P<0.05)。冷凍干燥的合歡米樣品中異槲皮苷含量顯著最高(P<0.05),其次是70、50 ℃、蒸汽殺青后烘干樣品。30 ℃烘干和陰干樣品,曬干、微波殺青后烘干和90 ℃烘干樣品中異槲皮苷含量無顯著性差異。冷凍干燥的合歡米樣品中槲皮素含量較低,槲皮苷含量在冷凍干燥、微波殺青后烘干和30 ℃烘干條件下變化不顯著,但含量顯著高于其他干燥方法(P<0.05)。曬干的合歡米樣品中異槲皮苷、槲皮苷和槲皮素含量都顯著較低(P<0.05)。

圖4 不同干燥方法處理的2種規格合歡花藥材中3種黃酮類成分含量

2.2 抗氧化活性

表2 不同干燥方式處理后2種規格合歡花類藥材的抗氧化活性

2.3 不同干燥處理的合歡花藥材化學質量特征綜合評價

2.3.1 主成分分析PCA

表3 主成分的特征值及方差貢獻率

表4 因子載荷矩陣

表5 不同干燥方法樣品的主成分得分及其綜合評價

不同干燥方法對2種規格合歡花藥材影響顯著,綜合評分表明盛開的合歡花適合宜采用70 ℃烘干處理,花蕾期的合歡米宜采用冷凍干燥處理。陰干的合歡花樣品綜合得分最低,曬干和陰干的合歡米樣品綜合得分也排名靠后,綜合評分表明陰干和曬干可能對合歡花和合歡米質量造成一定損失。

2.3.2 聚類分析CA

通過系統聚類分析可進一步揭示了樣品之間的差異和聯系(見圖5),樣品之間平方歐氏距離較長,對應的相似性較低,差異越大[21]。

圖5 不同干燥方式處理后合歡花(A)和合歡米(B)的聚類分析

聚類分析顯示,不同干燥處理的所有合歡花樣品均可歸入4個聚類。將曬干、50 ℃烘干、70 ℃烘干、蒸汽殺青后烘干、微波殺青后烘干和30 ℃烘干處理的合歡花樣品聚為一類,50 ℃烘干和70 ℃烘干樣品、蒸汽殺青后烘干和微波殺青后烘干樣品特別接近,說明它們具有相似的理化和抗氧化性能。將經30 ℃烘干處理的合歡花樣品分為第2類,陰干樣品分為第3類,冷凍干燥樣品分為第4類。冷凍干燥樣品距離其他干燥方式樣品最遠,說明其與其他干燥方式差異最大。不同干燥處理的所有合歡米樣品均可歸入3個聚類。曬干、陰干、50 ℃烘干、蒸汽殺青后烘干和微波殺青后烘干處理的合歡米樣品聚為一類,70 ℃烘干和90 ℃烘干樣品聚為第2類,30 ℃烘干和冷凍干燥樣品分為第3類。這可能是由于合歡米在這些干燥過程中的化學反應和轉化途徑導致,這說明合歡米代謝產物的活性成分和抗氧化能力存在明顯差異。合歡米樣品的3個聚類距離差明顯小于合歡花的,表明干燥方法對合歡米樣品質量的影響差異小于合歡花樣品。

2.3.3 黃酮類成分與抗氧化活性相關性分析

2種規格合歡花類藥材的化學物質和抗氧化性能是質量歸屬的關鍵。因此,為了解釋它們隨不同干燥處理的變化,我們進行活性成分含量與抗氧化活性的相關性分析。本研究中各變量之間的相關性不是線性的,且不完全滿足方差齊性的條件[22],同時為了避免由極值產生的虛假相關性[23],采用SPSS中Spearman相關系數檢驗分析來揭示2種規格合歡花類藥材活性化合物與抗氧化活性之間的相互關系(見表6)。

表6 不同干燥處理樣品黃酮類成分與抗氧化活性相關性分析

3 討論與結論

本文研究傳統干燥方法(曬干、陰干)、殺青干燥方法(蒸汽殺青后烘干、微波殺青后烘干)、烘干(30、50、70、90 ℃)和冷凍干燥對2種規格合歡花藥材品質影響。建立HPLC法測定異槲皮苷、槲皮苷和槲皮素含量,采用紫外可見分光光度法測定總黃酮含量,比較不同干燥處理合歡花藥材黃酮類成分含量差異。不同干燥處理的合歡花藥材黃酮類成分含量差異顯著。與傳統干燥方法相比,蒸汽殺青后烘干合歡花樣品總黃酮含量、異槲皮苷、槲皮苷含量均顯著較高,而槲皮素含量較低。冷凍干燥合歡米樣品中總黃酮和異槲皮苷含量顯著最高,蒸汽殺青后烘干樣品槲皮苷含量顯著最高。合適的“殺青”方法可以破壞新鮮植物體內酶活性,保留活性物質,此時透力較強的蒸汽殺青方法即能破壞細胞結構并抑制水解酶的活性,降低黃酮苷類成分的水解;冷凍干燥的過程中水分能直接從固態升華為氣態除去,低溫干燥可抑制水解酶的活性,也有利于活性成分的保存[24]。

合歡花中黃酮類成分異槲皮苷、槲皮苷及槲皮素為2種合歡花藥材中主要活性成分,具有明顯的抗氧化作用[25-27]。本文采用5種抗氧化方法來評價合歡花類藥材質量及其對不同自由基的清除活性,由于選擇的5種抗氧化方法實驗原理各不相同,可客觀綜合評價2種合歡花藥材抗氧化活性。實驗結果表明不同干燥處理合歡花藥材樣品抗氧化活性結果存在顯著差異。相關性分析進一步表明,槲皮苷與DPPH自由基清除能力、Fe3+還原能力、總抗氧化能力呈顯著正相關(P<0.05),ABTS自由基清除能力與總黃酮含量呈極顯著正相關(P<0.01),槲皮素含量與ABTS自由基清除能力呈顯著正相關(P<0.05),總黃酮含量和槲皮苷含量呈顯著正相關,槲皮苷含量可作為總黃酮含量大小的評價指標,推測槲皮苷和槲皮素是2種合歡花類藥材主要抗氧化活性物質。