基于響應面法優化牛蒡子多糖提取工藝及對細胞抗炎作用研究

潘博雅,孟憲群,康廷國,尹海波,許 亮,王 丹

遼寧中醫藥大學藥學院,大連 116600

牛蒡子為菊科植物牛蒡(ArctiumlappaL.)成熟的干燥果實,收錄于2020版《中國藥典》中。現代研究表明,牛蒡子因其具有多種藥理活性,例如抗炎、抗腫瘤、抗糖尿病腎病、調節免疫力、抗病毒、降血糖、利尿及瀉下等功效[1-3]而被廣泛研究。但目前關于牛蒡子活性成分的研究主要集中在木脂素類成分[4],而其中的多糖作為果實類中藥中富含的主要成分之一[5]在牛蒡子中卻研究較少。炎癥是機體免疫系統的第一道防線,是機體的一種自然保護性反應,但長時間的、慢性的炎癥可導致疾病的發生,如發燒、哮喘、動脈粥樣硬化、關節炎、神經退行性疾病甚至癌癥。目前對于炎癥的治療主要集中在類固醇和非類固醇抗炎藥物,但因其能夠引起高血壓、骨質疏松、免疫抑制、出血性胃炎、上消化道潰瘍、肝毒性、過敏等副作用,不能長期使用。因此亟待開發出一類安全、有效的新藥源[6]。近年來,天然多糖因其安全性、易得性和良好的抗炎活性而受到廣泛關注[7]。

因此,本研究在考察單因素條件的基礎上,采用響應面中的Box-Behnken方法,進行三因素三水平實驗設計。以牛蒡子多糖提取率為參考依據,構建牛蒡子多糖提取工藝最佳組配。通過建立以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)為誘導條件的RAW 246.7細胞炎癥模型,對牛蒡子多糖的相關抗炎機制進行初步研究,為開發新抗炎藥物和綜合利用牛蒡子多糖提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

牛蒡子(江蘇省徐州豐縣有限公司),經遼寧中醫藥大學康廷國教授鑒定為牛蒡(ArctiumlappaL.)干燥成熟果實。

1.2 試劑與設備

無水葡萄糖對照品(批號:M11bv141284,純度≥98%,北京索萊寶科技有限公司);CCK8試劑盒(批號:MA0218-Oct-171,北京博奧森生物技術有限公司);IL-6、TNF-αELISA試劑盒(批號:AD202112、AD202203,上海研謹科技有限公司);蒸餾水(杭州娃哈哈集團有限公司)。UV-5100型紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司);FA210SL型電子天平(華質電子科技有限公司);HH-ZK6型數顯式電熱恒溫水浴鍋、LY15-101-1型電熱恒溫干燥箱(上海龍躍儀器設備有限公司);TDZ4-WS型低速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)。

1.3 牛蒡子多糖的提取研究

1.3.1 多糖的提取

稱牛蒡子干燥粉末10 g,加甲醇(20 mL)進行熱回流提取。去除甲醇提取液,將藥渣揮干后,用1.5倍體積的蒸餾水加熱提取3次,每次2.5 h,將3次提取的水提液合并,用乙醇進行醇沉,測定乙醇終濃度為80%,醇沉過夜。將醇沉后的樣品通過丙酮淋溶后進行抽濾,將抽濾沉淀中的有機溶劑揮干,取適當沉淀物根據苯酚濃硫酸法,當反應液顏色為棕褐色,多次測量反應液的吸光度值趨于穩定時,即為純度較為穩定的牛蒡子粗多糖。

1.3.2 多糖純度的測定

采用高效凝膠滲透色譜(high performence gel permeation chromatography,HPGPC)法測量多糖純度。精密稱取樣品5 mg,溶解于1 mL的流動相溶液(0.05 mol/L NaCl溶液)中,配制成5 mg/mL溶液,超聲10 min后,12 000 r/min離心10 min。吸取上清液,用0.22 μm的水系微孔濾膜過濾備用。色譜方法為流動相:0.05 M NaCl溶液;色譜柱:BRT105-103-101串聯凝膠柱(8 mm× 300 mm);流速:0.8 mL/min;柱溫:40 ℃;進樣量:25 μL;檢測器:示差檢測器RID-20A;分析時間:60 min。

1.3.3 單因素考察

稱牛蒡子干燥粉末10 g,對提取多糖過程中涉及的3個因素(料液比、提取時間、提取溫度)進行實驗設計。以牛蒡子多糖提取率為參考響應值,測定不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)、提取時間(2、3、4、5、6 h)和提取溫度(60、70、80、90、100 ℃)對多糖提取的影響,確定各提取因素的最佳范圍。

1.3.4 響應面試驗設計

通過單因素實驗確定提取范圍之后,采取Box-Behnken設計方法,對確定范圍下的料液比、提取時間和提取溫度進行試驗組配,以多糖提取率為響應值指標,通過對不同組配的多糖提取,得到數據并進行分析,建立三個影響因素與響應值之間的擬合方程,生成響應圖,并利用軟件預測最佳工藝條件[8]。

1.4 牛蒡子多糖提取率的測定

取牛蒡子多糖樣品1 mL,使用修改的苯酚-濃硫酸法[9],以葡萄糖標準曲線為參考,測定牛蒡子多糖樣品在490 nm處吸光度值,通過標準曲線得到多糖濃度,并根據公式(1)計算其提取率。

(1)

式中:c(g/mL)代表牛蒡子多糖溶液濃度,V(mL)代表牛蒡子多糖溶液體積,m(g)代表牛蒡子用量。

1.5 RAW 246.7細胞培養

向DMEM高糖培養液中加入含10%的新生小牛血清及100 U/mL青霉素、鏈霉素,對RAW 264.7細胞進行培養。培養條件:5% CO2,溫度37 ℃,隔天換新培養液。每天觀察細胞的生長狀態。

1.6 CCK8法檢測細胞活力

取生長至70%～80%融合程度的RAW 264.7細胞,用0.25%胰蛋白酶消化。當細胞密度達到5 × 103個/mL時,接種到96孔板中,培養24 h。設置7個牛蒡子多糖質量濃度組(0、10、20、40、80、160、320 μg/mL),每組4個復孔。當細胞充分貼壁后,將孔內液體棄置,各組加入200 μL培養液,其中含有相應質量濃度的藥物,培養24 h棄掉孔內液體,每孔加入180 μL的完全培養基和20 μL的CCK8溶液,培養3 h,用酶標儀檢測各孔光密度(OD)值,計算各組細胞的相對存活率[10]。

1.7 牛蒡子多糖對RAW 264.7細胞增殖的影響

將RAW 264.7細胞隨機分成空白組,LPS模型組(1.0 μg/mL),牛蒡子多糖低、中、高劑量濃度組(20、40、80 μg/mL),每組設置3個復孔。用無血清培養液培養空白組細胞24 h,之后換新培養基繼續培養1 h,LPS模型組細胞在無血清培養液培養24 h后,加入含100 μg/mL的LPS培養基繼續培養1 h,牛蒡子多糖組分別換入含20、40、80 μg/mL牛蒡子多糖的培養基培養24 h,之后加入含100 μg/mL的LPS培養基繼續培養1 h。于波長450 nm處測定吸光度(OD)值,并計算細胞的生長抑制率。

1.8 RAW 246.7細胞上清液中TNF-α、IL-6水平檢測

收集不同處理組的RAW 264.7細胞上清液(3 000 r/min離心15 min),參照ELISA試劑盒說明書,檢測不同處理組細胞上清液中TNF-α和IL-6水平。

1.9 Western blot法檢測TLR4、MyD88和NF-κBp65的蛋白表達水平

收集每組細胞上清液,3 000 r/min離心15 min,取上清液,采用Western blot將蛋白質樣品通過12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,將所得蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯上,并在5%脫脂奶粉(磷酸鹽緩沖液,0.1%吐溫)中孵育。在所分析的檢測液中,檢測TLR4、MyD88和NF-κBp65的蛋白表達水平,通過分析著色位置和著色深度來判斷。

1.10 數據統計分析

Box-Behnken設計采用Design-Expert Software12.0軟件對響應面實驗數據進行二次多項回歸擬合方差分析。方差分析使用One-Way AVONA檢驗其顯著性,P< 0.05代表差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 多糖純度測定

采用HPGPC對牛蒡子粗多糖進行純度鑒定(見圖1)。通過已知分子量的標準葡聚糖作為標準品,根據葡聚糖凝膠標準曲線的測算,牛蒡子粗多糖的純度為80.73%。

圖1 牛蒡子粗多糖HPGPC圖

2.2 單因素實驗優化結果

2.2.1 提取料液比的影響

通過對牛蒡子多糖提取過程中不同料液比這一因素的研究,發現在1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL這5個料液比條件下,牛蒡子多糖提取率會隨著提取液占比的升高,出現增高趨勢(見圖2),當料液比為1∶15 g/mL時,牛蒡子多糖的提取率最高為7.03%。當繼續提高提取液比例,牛蒡子多糖的提取率又呈現下降的趨勢,這可能是由于過大的溶劑和溶質之間的濃度差,反而影響了牛蒡子多糖在水中的溶解度,進而影響了多糖的提取率。

圖2 不同料液比對牛蒡子多糖提取率的影響

2.2.2 提取時間的影響

通過對牛蒡子多糖提取過程中不同提取時間這一因素的研究,發現在2、3、4、5、6 h這5個提取時間條件下,牛蒡子多糖的提取率在3 h時達到最大值,為7.11%。之后隨著提取時間的繼續增加,多糖提取率呈現下降趨勢(見圖3)。可能是在多糖的提取過程中,提取時間過長會一定程度上破壞多糖結構,影響最終的多糖提取率。

圖3 不同提取時間對牛蒡子多糖提取率的影響

2.2.3 提取溫度的影響

通過對牛蒡子多糖提取過程中不同提取溫度這一因素的研究,發現在60、70、80、90、100 ℃這5個提取溫度條件下,在60～80 ℃溫度范圍內,多糖提取率隨著提取溫度的升高而增加。在80 ℃條件下,多糖提取率最高,為7.14%(見圖4)。當溫度繼續升高時,多糖提取率反而呈現下降趨勢,可能是過高的提取溫度會使多糖結構遭到一定程度的破壞,影響最終的多糖提取率。

圖4 不同提取溫度對牛蒡子多糖提取率的影響

2.3 響應面優化牛蒡子多糖的提取工藝組配結果

通過對上述三因素(料液比、提取溫度、提取時間)提取條件范圍的確定,基于Box-Behnken設計方法進行響應面實驗(見表1)。

表1 牛蒡子多糖提取條件響應面實驗設計及結果

根據Design expert軟件,獲得提取率對以上三個因素的擬合回歸方程為:多糖提取率=7.19+0.1 506A+0.1 138B+0.1 800C-0.1 000A×B-0.0 025A×C-0.0 075B×C-0.0 319A2-0.2 056B2-0.4 831C2,式中A代表料液比,B代表提取溫度,C代表提取時間。分析模型應用方差的結果表明:回歸方程具有較高的擬合度和可信度,獲得的實驗方案可靠。回歸系數R2> 0.9,說明自變量與響應值間含有線性關系,它的回歸方程可以進行最佳提取工藝條件優化。通過回歸方程進行響應面圖和等高線圖的繪制(圖5)。

圖5 響應面試驗優化牛蒡子多糖提取率

通過Box-Behnken設計17組不同的提取方式組配,并根據多糖提取率判定,預測牛蒡子多糖最佳的提取條件組合為:料液比為1∶15 g/mL,提取溫度為80 ℃,提取時間為3 h,在此組合下的多糖提取率可達7.29%。為了進一步驗證實驗結果,在此預測組配下進行3次平行實驗,得到的牛蒡子多糖提取率平均值為7.19%,基本符合預期結果。

2.4 RAW 246.7細胞培養

通過傳代的RAW 246.7細胞在光鏡下顯示其狀態生長旺盛,細胞透亮,核仁清晰,細胞碎片少(見圖6)。

圖6 傳代的RAW 246.7細胞生長情況

2.5 牛蒡子多糖對RAW 246.7細胞的毒性檢測

牛蒡子多糖對RAW 246.7細胞的毒性檢測結果見圖7。牛蒡子多糖濃度為10～320 μg/mL時,RAW 246.7細胞存活率均高于90%,可視為無細胞毒性。當牛蒡子多糖濃度為20、40、80 μg/mL時,細胞活力顯著提高(P <0.01)。因此,本研究選擇細胞活性較高的20、40、80 μg/mL牛蒡子多糖濃度組,進行后續實驗研究。

圖7 不同牛蒡子多糖濃度對RAW 246.7細胞生長活力的影響

2.6 不同處理組對LPS誘導的RAW 246.7細胞炎癥因子分泌的影響

通過檢測RAW 246.7細胞炎癥因子TNF-α和IL-6分泌情況發現,LPS模型組較空白組顯著升高(P< 0.01);與LPS模型組比較,40、80 μg/mL的牛蒡子多糖組TNF-α和IL-6分泌顯著降低(P< 0.05),且整體呈劑量依賴趨勢,而20 μg/mL的牛蒡子多糖組差異不顯著(見圖8)。許多文獻研究表明,多糖濃度在一定范圍內與抗炎活性呈一定的劑量依賴關系[11-14],但是對于多糖純度與抗炎活性的關系研究并未見報道,可以在后續的進一步研究中進行補充。

圖8 不同牛蒡子多糖濃度對RAW 246.7細胞炎癥因子的影響

2.7 不同處理組對LPS誘導的RAW 246.7細胞TLR4、MyD88及NF-κBp65蛋白表達的影響

通過對不同處理組細胞中TLR4、MyD88及NF-κBp65蛋白表達水平的檢測發現,與空白組相比,LPS模型組中蛋白表達水平顯著升高(P<0.01);與LPS模型組比較,20、40、80 μg/mL的牛蒡子多糖組細胞TLR4、和NF-κBp65表達顯著降低(P<0.05),并且呈一定的劑量依賴作用。對于MyD88蛋白表達水平,與LPS模型組相比,不同濃度的牛蒡子多糖組均存在一定的抑制作用,其中40、80 μg/mL的牛蒡子多糖組抑制作用顯著(P<0.05)(見圖9)。

3 結論

本文通過對牛蒡子多糖提取過程中的三個因素(料液比、時間和溫度)進行范圍確定研究,并在此基礎上,通過Box-Behnken進行三因素組配實驗設計,根據實際牛蒡子多糖提取率,得到牛蒡子多糖最佳提取工藝條件(料液比=1∶15 g/mL、提取時間3 h、提取溫度80 ℃)。通過研究不同濃度的牛蒡子多糖在細胞炎癥中的作用機制,發現牛蒡子多糖能夠抑制由LPS誘導的RAW 264.7細胞上清液中TNF-α和IL-6的分泌,并且能夠通過調控TLR4/MyD88/NF-κB通路上的相關蛋白起到免疫調控作用,該研究可為牛蒡子多糖的開發和應用奠定科學基礎,為牛蒡在抗炎作用方面的開發應用提供技術參考。