基于HPLC-QQQ-MS技術探討炮制對肉蓯蓉中5個活性成分的含量影響

雷慧博,余雅婷,韓 璐,吳 巖,原永芳,俞曉艷

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院藥劑科,上海 200011

肉蓯蓉(Cistanchetubulosa)為我國補益類珍貴中草藥,收錄于《神農(nóng)本草經(jīng)》中的上品,具有補肝腎、益精血、潤腸通便、延緩衰老等功效,用于治療腎虛、女性不育、便秘、提高記憶力、治療阿爾茨海默病和提高免疫力[1-4]。肉蓯蓉成分多種多樣,包括苯乙醇苷、苯甲醇苷、環(huán)烯醚萜及其苷、木脂素及其苷多糖類等,其廣泛的藥理活性,和它所含的生物活性成分密不可分。例如,肉蓯蓉多糖可很好地清除羥自由基,有顯著的抗氧化活性[5]。毛蕊花糖苷和松果菊苷等苯乙醇苷類成分,可通過提高血液的血氧氣飽和度,增加機體耐受力,改善慢性高原病[6]。松果菊苷已被研究證明具有抗帕金森病的作用[7]。為深入地探索肉蓯蓉的活性成分和藥理藥效,我們前期曾對該種屬的化學成分和藥理作用有過系統(tǒng)的總結[8]。

由于肉蓯蓉明顯而顯著的藥理活性,對其活性成分的關注也相對較多,含量測定的研究也多面地開展[9-14]。不同的研究技術如串聯(lián)耦合反相-親水相互作用色譜-串聯(lián)質譜法曾用于測定肉蓯蓉中不同極性和含量范圍的成分[15]。有研究利用一種相對校正因子計算方法,通過一種標記物對肉蓯蓉苯乙醇苷類化合物的多種成分進行了比較分析[16]。還有采用紫外分光光度法、苯酚-硫酸法和高效液相色譜法對生品肉蓯蓉及炮制品中的總苯乙醇苷類、總多糖和4種代表性的成分含量的變化進行了分析[17]。這些研究方法有些不能夠絕對定量,有些則靈敏度不高,而作為具有低檢測限高靈敏度的高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜法(high-performance liquid chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry,HPLC-QQQ-MS)技術,更適合于成分含量低且復雜的肉蓯蓉樣品的分析中。

中藥炮制是中醫(yī)學中一種獨特而獨特的制藥技術,在減少副作用、提高藥效、改變藥材性質甚至改變療效方面發(fā)揮了重要作用。炮制可以使中藥關鍵藥效物質基礎發(fā)生變化,進而提高藥效[18],傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認為,酒制可以使補腎類藥物更好地發(fā)揮藥效,因此肉蓯蓉歷來用黃酒進行炮制后入藥[19-21]。為更好地評價炮制對肉蓯蓉化學物質基礎的影響,我們曾對炮制前后肉蓯蓉的入血成分和代謝組學進行過系統(tǒng)的研究[22],并在前期對炮制前后肉蓯蓉化合物鑒定及篩選質量標志物的基礎上[23],本次選取肉蓯蓉中5個代表性的化合物肉蓯蓉苷F、毛蕊花糖苷、異麥角甾苷、2′-乙酰基毛蕊花糖苷、松果菊苷,從定量的角度進行分析,在HPLC-QQQ-MS儀器上建立了肉蓯蓉化學成分含量測定的方法。該5個成分中的肉蓯蓉苷F屬于苯丙烯酰寡糖類化合物,其余四個為苯乙醇苷類化合物,均具有較明顯的藥理活性[24,25]。毛蕊花糖苷和松果菊苷更是歷版《中華人民共和國藥典》中作為質量控制的對照品[26]。本實驗將從定量分析的角度,為后續(xù)肉蓯蓉炮制增效及其質量評價提供理論依據(jù)。

1 材料與材料

1.1 儀器

Milli-Q50 SP超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司);Shimadzu LC-20AD XR液相系統(tǒng)(日本Shimadzu公司);SCIEX 4500QTRAPTM三重四級桿系統(tǒng)(美國SCIEX公司);AnalystTM1.6.3數(shù)據(jù)處理工作站(美國SCIEX公司);MultiQuantTM定量分析工作站(美國SCIEX公司)。

1.2 材料

對照品松果菊苷(純度≥98%,批號B212009)、毛蕊花糖苷(純度≥98%,批號B271307)和異毛蕊花糖苷(純度≥98%,批號B271306)(葉源生物科技有限公司);肉蓯蓉苷F(純度≥98%,批號Y-200-190568)、2′-乙酰基毛蕊花糖苷(純度≥98%,批號Y-200-190422)、內(nèi)標物木通苯乙醇苷(純度≥98%,批號Y-200-190346)(成都曼斯特生物科技有限公司)。同一批次的肉蓯蓉生品和炮制品(批號2018111102)由山西廣譽遠國藥有限公司(中國,山西)提供,藥材均經(jīng)廣譽遠國藥質量部郝晉琪部長鑒定為肉蓯蓉(Cistanchetubulosa)的干燥肉質莖部位。

質譜級甲醇和乙腈(Fisher Scientific,美國);質譜級甲酸(Sigma-Aldrich,美國),其他試劑為分析純。實驗中超純水由MilliQ50 SP純水系統(tǒng)制備。

2 方法與結果

2.1 肉蓯蓉生品與炮制品供試品溶液的制備

肉蓯蓉供試品制備方法同《中國藥典》2020年版一部含量測定項下方法[7],具體操作如下:取生肉蓯蓉粉末1.0 g,精密稱定,置100 mL棕色量瓶中,精密加入50 mL 50%的甲醇溶液,密塞,搖勻,稱定重量,室溫下浸泡30 min后,超聲處理30 min(功率250 W,頻率20 kHz),放冷,再稱定重量,加50%甲醇補足減失的重量,搖勻,靜置,取上清液,上清液在4 ℃下以13 000 r/min離心10 min,然后用質譜級甲醇以1∶100的比例稀釋,即得。取1 μL用于HPLC-QQQ-MS分析。每個提取液平行兩次。

炮肉蓯蓉供試品溶液的制備方法同生品一致。

2.2 對照品溶液的配制

分別精密稱量對照品松果菊苷5.00 mg、毛蕊花糖苷5.00 mg、異毛蕊花糖苷5.08 mg、肉蓯蓉苷F 5.16 mg、2′-乙酰基毛蕊花糖苷5.15 mg和木通苯乙醇苷5.10 mg分別置于5 mL容量瓶中,加50%甲醇溶解并稀釋至刻度,得1 mg/mL的單一對照品儲備液。所有儲備液均置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩嶒炃芭渲苹旌蠘藴势啡芤翰⒂?0%甲醇稀釋得到一系列不同濃度的混合標準品溶液,所有標準品溶液均4 ℃下13 000 r/min離心10 min,取上清,將1 μL混合標準溶液注入HPLC-QQQ-MS系統(tǒng)分析。

2.3 液質分析

色譜條件:為使待測物各色譜峰獲得較好的分離效果,本研究對流動相、色譜柱、柱溫、流速和進樣量這幾個色譜條件進行了優(yōu)化。通過前期實驗考察,最終確定肉蓯蓉含量測定色譜條件為,儀器:島津LC-20AD液相色譜儀(二元梯度泵、在線真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器);色譜柱:Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(2.1 mm × 150 mm,1.8 μm);進樣量:1 μL;流動相:0.1%甲酸水(A)-乙腈(B);梯度洗脫程序:0～6 min,5%→30%B;6～12 min,30%→33%B;12～12.1 min,33%→5%B;12.1～14 min,5%→5%B;流速:0.3 mL/min;柱溫:35 ℃;樣品管理器溫度:8 ℃;分析時間:15 min。

質譜條件:肉蓯蓉含量測定所用質譜儀器為SCIEX 4500 QTRAPTM三重四級桿質量分析器質譜,離子源為電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI)。AnalystTM1.6.3工作站對質譜數(shù)據(jù)進行采集和處理。實驗首先在SCIEX 4500 QTRAPTM質譜的針泵系統(tǒng)上對5個待測物及內(nèi)標物的質譜條件進行了優(yōu)化。接著通過正、負離子全掃描,發(fā)現(xiàn)各待測物及內(nèi)標母離子在負離子模式下響應較好,因此選用該模式進行質譜數(shù)據(jù)的采集,并確定負離子模式下的母離子。再次,在子離子掃描模式下確定響應值較高的子離子,選擇用母離子和子離子對來對各待測物進行定量分析。最后,在高靈敏度的負離子模式下的多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式下,對碰撞能(collision energy,CE)、去簇電壓(declustering potential,DP)和出口電壓(cell exit potential,CXP)進行優(yōu)化。優(yōu)化結果見圖1。最終確定的質譜條件為:負離子模式下的MRM掃描方式。霧化氣、干燥氣和碰撞氣均為氮氣;優(yōu)化質譜參數(shù)為:干燥氣溫度(temperature):550 ℃;霧化氣壓力(curtain gas):40 psi;碰撞氣(collision gas):Medium;離子噴霧電壓(ion spray voltage):4 500(-);Gs1:50 psi;Gs2:50 psi。各待測成分優(yōu)化的MRM參數(shù)見表1。

圖1 HPLC-QQQ-MS法在MRM模式下5個待測物的色譜圖

表1 各待測成分和內(nèi)標的質譜檢測參數(shù)

2.4 方法學考察

專屬性考察:對照品、肉蓯蓉生品和肉蓯蓉炮制品的色譜圖見圖1。負離子模式下肉蓯蓉苷F、毛蕊花糖苷、異麥角甾苷、2′-乙酰基毛蕊花糖苷、松果菊苷的保留時間分別是5.35、7.39、7.13、7.84和6.27 min。所有分析物在各自的保留時間內(nèi)響應良好并且沒有明顯的干擾。本研究中內(nèi)標化合物的選擇標準是以色譜行為與待測化合物相近,質譜行為不會對待測化合物產(chǎn)生干擾為最佳。本實驗經(jīng)過條件考察和查閱文獻[27],選用木通苯乙醇苷為內(nèi)標化合物,該化合物和苯乙醇苷類化合物結構相似,且在肉蓯蓉生品和炮制品中均未檢測到。

線性、檢測限、定量限考察:根據(jù)待測物的前期預實驗考察的結果確定一定的濃度范圍,選擇濃度適中的6個濃度點,以待測物的濃度為(x),待測物與內(nèi)標峰面積的比值為(y),采用加權最小二乘法擬合線性回歸得標準曲線方程,應使待測物的濃度盡量在標準曲線的定量檢測范圍之內(nèi)。其中,檢測限(limit of detection,LOD)的信噪比(signal to noise ratio,S/N)應大于3。定量限(limit of quantitation,LOQ)的S/N應大于10。肉蓯蓉苷F、毛蕊花糖苷、異麥角甾苷、2′-乙酰基毛蕊花糖苷、松果菊苷的標準曲線、定量限、檢測限見表2。相關系數(shù)(r)在0.992 9～0.998 5之間,標準曲線線性關系良好,標準曲線圖見圖2。

圖2 5個待測物的標準曲線圖

表2 HPLC-QQQ-MS法對肉蓯蓉中5個待測成分的線性、檢測限、定量限的考察

精密度、重復性、穩(wěn)定性、加樣回收率考察:按“2.2”項下制備高、中、低3個不同濃度的QC樣品,每個濃度平行6份進行分析。分別于同一天內(nèi)和連續(xù)3天內(nèi)完成測定,計算日內(nèi)精密度,日間精密度。精密度均以RSD表示,應保證其值不超過10%。通過在一天內(nèi)和連續(xù)三天平行六次測量高、中、低三種濃度水平的標準溶液來測定日內(nèi)和日間的精密度。最終測得日內(nèi)、日間精密度的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)分別低于7.41%和7.42%。重復性考察的對象為肉蓯蓉生品,按照“2.2”項下對樣品進行前處理,每個濃度平行6份,結果表明各個化合物可以在室溫下24 h內(nèi)進行常規(guī)分析。用樣品溶液來評價穩(wěn)定性,其結果分別在0、2、4、8、12和24 h內(nèi)測定。最終穩(wěn)定性和重復性的RSD分別低于6.1%和6.2%。回收率共制備三組樣品,每組樣品有高、中、低3個濃度,每個濃度平行3份。三組樣品分別是:對照品溶液(A);標準溶液制備QC樣品按“2.1”項下處理樣品(B);生品肉蓯蓉樣品按“2.1”項下處理樣品(C)。將三組樣品進樣分析,通過每組樣品響應的峰面積來計算,提取回收率=(實驗測得量/理論加入量)×100%。本實驗的回收率為98.15%～100.2%,RSD值小于4.6%,具有較高的定量準確度。詳細結果見表3和表4所示。

表3 精密度、穩(wěn)定性、準確性考察

2.5 樣品含量測定結果

通過實驗條件優(yōu)化及方法學考察,本節(jié)所建立的方法適用于肉蓯蓉炮制前后5個化學成分的檢測,其詳細結果見表5。

表5 HPLC-QQQ-MS法對肉蓯蓉中5個化合物的含量測定

3 討論與結論

本本節(jié)所建立的HPLC-QQQ-MS方法主要用于炮制前后肉蓯蓉中5個化學成分的測定。實驗以中藥質量標準理論為指導,根據(jù)現(xiàn)代藥理研究進行含量測定成分的篩選,最終選擇肉蓯蓉苷F、毛蕊花糖苷、異麥角甾苷、2′-乙酰基毛蕊花糖苷、松果菊苷為指標成分。實驗參照2020年版《中國藥典》一部中肉蓯蓉含量測定項下的提取方法對肉蓯蓉生品和炮制品進行樣品提取,并對5個化學成分的液相和質譜條件進行了優(yōu)化。實驗中所使用的高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜儀具有高分辨率、高靈敏度、快速分析等優(yōu)點。能夠對化合物進行高效地分離和篩選,并可以對不同的分子進行定量分析,可以檢測到極小的分子,并且可對復雜混合化學成分進行高效、快速的分析。因此,憑借該平臺建立的研究方法非常適合本實驗炮制前后肉蓯蓉具有微小含量變化的成分的檢測。結合方法學考察結果可以發(fā)現(xiàn),本節(jié)所建立的方法具有較高的精密度,準確度及耐用性,因此該方法可以用于炮制前后肉蓯蓉中化合物的含量測定,其結果可以用于對炮制前后肉蓯蓉的質量評價。

肉蓯蓉在炮制過程中,由于受加熱的影響,其中有些化合物可能會發(fā)生水解、氧化、酶促、異構化反應,使其成分含量降低或增加。如毛蕊花糖苷通過異構化生成異麥角甾苷,使得毛蕊花糖苷含量降低的同時異麥角甾苷的含量隨之升高,而松果菊苷在炮制過程中則易發(fā)生水解反應使其含量降低。因此,為了更好地發(fā)揮藥效,中藥在炮制過程中要著重關注主要成分的含量變化,避免出現(xiàn)炮制不及或炮制過度的現(xiàn)象。總體來說,本研究的研究結果為后續(xù)肉蓯蓉的質量評價提供了理論依據(jù),并從定量分析的角度,證明了肉蓯蓉炮制的意義。