柴胡皂苷A抗抑郁的靶點識別及作用研究

任 歷,邵鈺婷,秦書華,楊文強,劉 瑩,*

1錦州醫科大學基礎醫學院,錦州 121000;2昆明理工大學生命科學與技術學院,昆明 650500;3錦州醫科大學生命科學研究院,錦州 121000

抑郁癥是一種常見的精神系統疾病,其發病率逐年上升,預計到2030年,抑郁癥將成為全球非正常死亡和殘疾的首要原因。

中藥柴胡具有疏肝解郁、清熱解表的功效,常作為治療抑郁癥的中藥復方中的君藥,如小柴胡湯、柴胡疏肝散及柴胡桂枝湯等。柴胡中主要活性成分為三萜皂苷類化合物柴胡皂苷,其中柴胡皂苷A(saikosaponin A,SSA)、柴胡皂苷B2(saikosaponin B2,SSB2)和柴胡皂苷D(saikosaponin D,SSD)是柴胡皂苷的主要藥效成分[1]。研究表明,SSA通過增加抑郁模型大鼠腦內單胺類神經遞質含量,激活p-CREB/BDNF通路,并抑制海馬神經元凋亡發揮抗抑郁作用[2]。此外,SSA通過增強大鼠海馬組織的BDNF-TrKB信號通路,進而發揮抗抑郁的作用[3]。SSA亦能通過增加富含脯氨酸的跨膜蛋白(proline-rich transmembrane proteins,PRRT2)的表達,升高海馬組織內多巴胺(dopamine receptor,DA)含量,發揮抗抑郁的作用[2]。雖然SSA的抗抑郁作用已經明確,但是既往的研究僅僅利用神經遞質含量改變來表征SSA的抗抑郁作用,檢測指標單一,機制研究也較少,不能全面闡釋抗抑郁藥物的作用靶點。為了明確SSA的抗抑郁作用及作用靶點,本文擬構建慢性不可預知性溫和應激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)模型小鼠,利用小鼠懸尾(tail suspension test,TST)和強迫游泳實驗(forced swimming test,FST)明確SSA的抗抑郁作用;進一步地利用計算機分子對接技術分析SSA的靶標,并利用細胞熱轉移測定實驗(cellular thermal shift assay,CETSA)和藥物親和力靶穩定性實驗(drug affinity responsive target stability,DARTS)驗證SSA的靶標;并采用Western blotting等技術研究SSA的抗抑郁作用機制。本研究將為小分子藥物靶點發現提供新的方法和策略。

抑郁癥發病機制目前尚不清楚,存在多假說[4],其中單胺類神經遞質紊亂假說在抑郁癥的發病中扮演著重要的角色。與神經遞質紊亂相關受體,如:5-羥色胺受體(5-serotonin receptor,5-HT)、多巴胺受體(dopamine receptor,DAR)、褪黑素受體(melatonin receptor,MT)、催產素受體(oxytocin receptor,OXTR)等都是G蛋白偶聯受體;對抑郁癥患者的研究顯示,催產素及其受體基因與抑郁癥具有相關性[5],催產素(oxytocin,OT)是一種由9個氨基酸構成的垂體神經肽,它能降低焦慮水平、增強鎮靜,具有明顯的抗抑郁作用;其特異性的靶向OXTR的表達、激活與抑郁、焦慮以及壓力所引發的一些病癥相關[5]。因此,OXTR是SSA抗抑郁作用的最主要靶點之一。本研究擬對抑郁癥相關的G蛋白偶聯受體進行全面分析,明確SSA抗抑郁的作用靶點。本文旨在研究SSA抗抑郁的作用靶點和機制,為抑郁癥等精神疾病的臨床研究和新藥開發提供必要的理論與參考依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

1.1.1 實驗動物

SPF級C57/B6雄性小鼠48只,共分為6組,每組8只,4～5周齡,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[動物生產許可證號:SCXK(京)2016-0006];動物使用許可證號:SYXK[遼]2019-0007。本研究動物實驗在錦州醫科大學實驗動物中心進行,經錦州醫科大學實驗動物倫理委員會批準(批準號:2022015)。

1.1.2 細胞

穩定的誘導表達pcDNA5/FRT/TO和pcDNA5/FRT/TO-VSV-GluR-OXTR細胞系由前期構建完成并保藏。

1.2 藥物及試劑

SSA(上海源葉生物科技有限公司,規格:1 g,批號:20171229);氟西汀(鹽酸鹽)(fluoxetine)(上海薩恩化學技術(上海)有限公司,規格:1 g,批號:CL090016);Way-267464(重慶金麥生物科技有限公司,規格:10 mg,批號:1432043-31-6)。

胎牛血清(批號:10091-148,規格:500 mL)、DMEM培養基(批號:C11875500BT,規格:500 mL)、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(批號:20200906,規格:100 mL)、Lipofectamine 2000(批號:11668019,規格:1.5 mL)(賽默飛世爾(美國)有限公司);Anti-ERK(批號:9102S,規格:100 μL)、anti-pERK(批號:5726S,規格:100 μL)、anti-GAPDH(批號:2146S,規格:100 μL)、anti-OXTR(批號:ABN297,規格:100 μL)、anti-VSV-G(批號:81454S,規格:100 μL)等抗體(Cell signaling Technology公司)。

1.3 主要儀器

小鼠動物行為機能系統Video Tracking System(型號:ANY-maze,Anymaze,Stoelting Co.,Wood Dale,USA);小鼠懸尾測試儀(型號:BW-YLS-18A,成都泰盟科技技術有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 CUMS模型小鼠的建立

除正常對照組外,其余小鼠均采用CUMS法制備小鼠抑郁模型[6]。建模過程如下:禁食、禁水(24 h)、晝夜顛倒(12 h/12 h)、強迫游泳(10 min)、噪聲(30 min)、頻閃(12 h)、動物束縛(12 h)、濕墊料(12 h)、傾籠45°(12 h),夾尾(尾尖1 cm處)2 min、陌生異常物品刺激(如塑料杯、牙刷等)過夜,每天隨機采取2～3種不同方式進行不規律刺激,連續4周。

1.4.2 分組與給藥

小鼠連續造模4周后,糖水偏愛實驗檢測CUMS模型小鼠造模是否成功,將小鼠分為空白組(control,Con)、模型組(model,Mod),Fluoxetine組(Flu,20 mg/kg),SSA低劑量組(SSA-L,10 mg/kg),SSA中劑量組(SSA-M,20 mg/kg),SSA高劑量組(SSA-H,40 mg/kg),每組8只小鼠,分組后1 d開始灌胃給藥,空白組給予等體積溶劑,每日1次,給藥時間為上午10∶00,連續灌胃給藥4周,各組于給藥后1 h繼續進行CUMS刺激。

1.4.3 小鼠懸尾實驗

連續給藥4周后,利用CUMS模型TST[7]檢測SSA對小鼠不動時間的影響。實驗全程通常持續6 min,TST不動時間一般被評價為小鼠絕望狀態。自制離地面高度20 cm的紙箱,紙箱一面敞開,便于觀察小鼠,其余各面封閉,避免外界環境的干擾,從其中一個側面穿一小圓孔,將小鼠尾巴從圓孔穿過去,一位實驗員抓小鼠尾根1/3處保持不動,另一位實驗員記錄小鼠不動的時間。前2 min讓小鼠適應環境,后4 min記錄不動時間,實驗過程中保持實驗室環境安靜,采用ANY-maze自動采集系統進行小鼠不動時間的測定。

1.4.4 小鼠強迫游泳實驗

連續給藥4周后,利用CUMS模型FST[7]檢測SSA對小鼠不動時間的影響。將小鼠放入高30 cm,直徑20 cm的圓柱形游泳池,水位15 cm,水溫23～25 ℃,將小鼠放置在水中6 min,前2 min讓其適應環境后,記錄后4 min中內不動的時間,當小鼠以直立的姿勢漂浮,只做一些小動作把頭露出水面時才被判斷為不動。每次測完后換水,實驗過程中保持實驗室環境安靜,采用ANY-maze自動采集系統進行測定。

1.4.5 細胞培養

穩定表達pcDNA5/FRT/TO-VSV-GluR-OXTR細胞株培養于含10%的胎牛血清(FBS)、100 U/mL的青霉素、100 μg/mL的鏈霉素、3.3 μg/mL Blasticitin、60 μg/mL Hygromycin的DMEM(Gibco)維持培養基中。細胞培養箱的環境為37 ℃、5% CO2。

1.4.6 Western blotting

蛋白樣品收集并經過BCA法定量,采用聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳對蛋白樣品進行分離,并轉移到PVDF膜上,經過封閉、孵育一抗、二抗后,再經ECL化學發光儀顯影,可根據條帶大小位置和顏色深淺對目的蛋白的表達水平進行分析。

1.4.7 CETSA實驗

CETSA[8]可監測配體和靶蛋白之間的物理相互作用,并且基于Western blotting和抗體對靶蛋白有高選擇性。當細胞生長匯合度達到60%時,多西環素誘導穩定表達細胞系36 h后,棄去培養基,不同濃度的藥物處理細胞3 h。收集細胞,用加入了蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的冰冷PBS重懸細胞,混勻后均分至7個PCR小管。PCR儀設置七個溫度梯度:40、44、48、52、56、60、64 ℃處理細胞懸液3 min,室溫放置3 min,之后在液氮和水中反復凍融5次,使細胞壁破碎。4 ℃,20 000×g離心25 min,小心吸取上清液至新的EP管,避免吸到沉淀。加入5×loading buffer后混勻,96 ℃煮樣3 min。

1.4.8 DARTS實驗

DARTS[9]是一種無標記直接對靶蛋白進行識別的方法,即靶蛋白的結構穩定性是通過與其相應配體的結合而改變的。該法通過改變在蛋白酶處理下的蛋白水解模式,從而檢測靶蛋白穩定性的變化。具體操作步驟如下:

當細胞生長匯合度達到60%時,多西環素誘導穩定表達細胞系36 h后,棄去培養基,不同濃度的藥物處理細胞3 h,收集細胞。加入IP Buffer,混勻后置于冰上,裂解30 min。樣品于4 ℃,12 000×g離心20 min,將上清收集至新的EP管中加入10×TNC buffer,充分混勻。BCA法測定細胞裂解液中蛋白質的濃度后,將樣品每管均分成三份,加入指定濃度的藥物(用培養基配制),24 ℃水浴中恒溫處理50 min。將每一管加藥處理后的樣品均分,加入2 μL酶與蛋白的比例為0、1∶10 000、1∶5 000、1∶1000所對應的酶(用1×TNC buffer配制),24 ℃水浴中恒溫處理20 min。加入5×loading buffer后混勻,96 ℃煮樣3 min。

1.4.9 計算機分子對接

使用Molecular Operating Environment(MOE)軟件輔助預測配體分子與靶標之間的相互作用[10]。制備并使用Minimize功能對配體的結構進行優化。之后準備蛋白質受體,從靶蛋白PDB數據庫中獲取受體蛋白的三維結構;將蛋白質結構導入到MOE,刪除水分子以及有機溶劑,只保留蛋白質以及原始底物配體,設置對接參數并選擇對接活性口袋為Ligand Atoms。最后進行分子對接:對配體和定義好口袋的受體進行分子對接,保存好的分子數據庫路徑輸入到對話框。初對接產生50個構象并輸出3個對接結果供參考,其余的參數保留默認設置。評價的標準主要看S,即Score,其值越小代表這個構象的小分子與配體結合更加緊密。

1.5 統計學分析方法

2 實驗結果

2.1 SSA對CUMS模型小鼠行為學的影響

TST實驗結果表明,與空白組相比(小鼠在懸尾環境中平均不動時間為82.3±12.8 s),模型組小鼠在懸尾環境中的平均不動時間明顯增加,為139.3±17.6 s,說明小鼠出現行為絕望的抑郁行為;與模型組相比,陽性對照Flu組的平均不動時間明顯降低,為99.6±37.5 s;SSA高、中、低劑量組小鼠TST不動時間顯著縮短(P<0.05或P<0.01);結果表明SSA能夠顯著縮短小鼠的不動時間,具有潛在的抗抑郁作用(見圖1)。

圖1 SSA對CUMS模型TST不動時間的

強迫游泳實驗結果表明,與空白組相比(小鼠在強迫游泳環境中平均不動時間為125.3±9.4 s),模型組小鼠在強迫游泳環境中的平均不動時間明顯增加,為143.9±13.6 s,說明小鼠出現行為絕望的抑郁行為;與模型組相比,陽性對照Flu組的平均不動時間明顯降低,為114.3±10.4 s;SSA高、中、低劑量組小鼠FST不動時間顯著縮短(P<0.05或P<0.01);結果表明SSA能夠顯著縮短小鼠的不動時間,具有潛在的抗抑郁作用(見圖2)。

圖2 SSA對CUMS模型小鼠FST不動時間的影響

2.2 SSA作用靶點的預測與驗證

在Drugbank數據庫中查詢6個抑郁癥相關受體(OXTR、MT1、MT2、5HTIB、5HT2A、CB1)(見表1),各選取5個能夠與受體結合的小分子化合物作為參照配體,包括受體的激動劑或拮抗劑。通過比較結合能反映小分子化合物與受體的結合情況,其中參照配體與受體的結合能既是陽性對照,同時也保證了分子對接過程中的方法正確。將數據進行歸一化處理后得到柴胡皂苷單體化合物與6種受體結合能的熱圖。

表1 抑郁癥相關的G蛋白偶聯受體及其功能

受體與配體的結合能的值越小,表明該小分子與受體結合更緊密、親和力更強。分子對接結果表明,SSA與OXTR結合能最小(-8.55 kcal/mol),與激動劑Way的結合能(-8.27 kcal/mol)相近;SSA與5HTIB的結合能為-9.43 kcal/mol,SSA與OXTR、5HTIB的結合能力均強于陽性對照。此外,SSA與5HT2A的結合能遠大于5HT2A的參照配體;SSA與MT1、MT2和CB1的結合能均為正值,表明SSA與MT1、MT2和CB1受體之間結合能力很弱或不結合(見圖3)。

圖3 SSA與6種受體結合能的熱圖

此外,分子對接結果表明,SSA與OXTR的氨基酸殘基GLU 307、GLN 295、GLN 92形成3個穩定的氫鍵;與PHE 311、ILE 210、TYR 200、ILE 204、LEU 120、SER 319、ALA 318、VAL 88、TRP 288、GLN 171、MET 123、GLN 119、LYS 116、ALA 189、GLN 96、TRP 99之間形成范德華力;與PHE 175、TRP 188、PHE 291、ILE 312、MET 315形成疏水性相互作用力(圖4A、4B)。

圖4 SSA與OXTR的結合模式圖

CETSA結果表明,隨著溫度升高,蛋白的變性程度越強,40 ℃時蛋白基本不變性,而64 ℃時蛋白基本完全變性。在40、44、48 ℃三個溫度下,1 μmol/L的SSA能夠明顯抑制OXTR的熱變性作用,而10 μmol/L的SSA對OXTR的熱變性無明顯抑制作用;提示SSA非劑量依賴性地與OXTR結合,并能顯著增強受體的結構穩定性,延緩受體的熱變性作用(見圖5A、5B)。

圖5 細胞熱轉移測定法驗證SSA作用靶點電泳圖

DARTS結果表明,酶:蛋白比值越小,受體蛋白水解程度越弱;比值為1∶10 000時,受體蛋白水解程度最弱,比值為1∶1 000時,受體蛋白水解程度最強;提示SSA能夠與OXTR結合,抑制酶對受體蛋白的水解作用(見圖6)。以上結果表明,SSA能夠與OXTR結合,并以OXTR為靶點發揮抗抑郁作用。

圖6 藥物親和力反應靶穩定性法驗證SSA作用靶點電泳圖

2.3 SSA對OXTR受體及其下游信號通路激活的影響

Western blotting實驗結果顯示,與OXTR激動劑(Way-267464,Way)組相比,SSA對OXTR下游的ERK1/2通路沒有明顯的激活作用,可能的原因是SSA雖然能夠激活OXTR,但并未激活其下游ERK1/2通路(見圖7A)。此外,SSD(SSA的同分異構體)亦能激活OXTR但并不激活其下游的ERK1/2通路(見圖7B),提示SSA激活OXTR發揮抗抑郁作用并不通過ERK1/2通路。

圖7 各組OXTR下游ERK1/2通路的表達結果及電泳圖

3 討論與結論

抑郁癥對患者的生活和工作產生了極大的影響,給患者家庭和社會帶來巨大的負擔。抑郁癥的病理機制復雜,目前市售的各類抗抑郁藥物,大多起效較慢,治愈率差,無法從根本上治愈,且不良反應發生率高。因此,開發一種全新的抗抑郁藥物,對抑郁癥的臨床治療具有重要的應用價值,將給抑郁癥患者帶來希望與福音。

柴胡具有多種藥理作用,包括抗炎、抗癌、抗病毒、抗菌、保肝和免疫調節作用[16]。近年來,中藥治療抑郁癥已取得顯著療效?，F有數據表明,抗抑郁用藥的1/3為柴胡類中藥方劑,表明柴胡在抑郁癥治療中的重要性。柴胡中具有抗抑郁作用的活性成分主要包括:SSA、SSB2和SSD,其中SSA和SSD的分子式相同,僅在空間結構上存在差,因此,研究SSA的抗抑郁機制對中藥柴胡的開發利用具有重要意義。盡管柴胡皂苷對抑郁癥的有益作用已經確立,但其作用機制尚不明確。

催產素被認為在親密感、社交認可、伴侶間的聯系和焦慮等方面具有一定的作用。而OXTR與抑郁、焦慮以及壓力所引發的一些病癥也存在一定的聯系,其可以通過對下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)和海馬神經元靶標的調節來改善患者的抑郁癥狀[2,5],所以OXTR很有可能成為抑郁癥治療的新靶點。

本研究首先以前期細胞篩選的結果為基礎,以CUMS模型小鼠為載體,利用TST和FST檢測SSA的抗抑郁作用,實驗結果表明SSA具有顯著的抗抑郁作用,其抗抑郁的效果與陽性對照Fluoxetine相當。進一步地,利用計算機分子對接技術、CETSA、DARTS明確了SSA的作用靶標。

MAPK通路的激活,特別是MEK1/2磷酸化激活是催產素發揮抗焦慮作用的一個重要途徑,而ERK1/2是MAPK途徑中的主要激酶之一[17]。因此,本研究通過檢測ERK1/2的磷酸化水平的改變來初步判斷小分子化合物的抗抑郁藥效。雖然分子對接實驗、細胞熱轉移測定實驗以及藥物親和力反應靶穩定性實驗均顯示出SSA與OXTR結合,且SSA與OXTR的結合能力強于SSB2。但在ERK1/2磷酸化水平檢測實驗中SSA對OXTR下游的ERK1/2通路沒有激活作用。可能的原因是SSA雖然能夠與OXTR結合,但它與OXTR結合后發揮抗抑郁作用并不通過MAPK途徑。OXTR可與多種G蛋白偶聯(包括Gq和Gi),而這些G蛋白可能將OXTR信號傳導至不同的細胞內途徑,從而導致不同的細胞功能。該結果與前人的報道一致,例如在前列腺癌細胞中,活化的OXTR主要依賴于Gi途徑介導前列腺癌細胞的遷移,且在該過程中并未激活ERK1/2通路[18]。此外,SSA通過抑制脂多糖(LPS)誘導的核轉錄因子κB(NF-κB)和κB抑制劑(IκBα)的磷酸化水平,發揮保護LPS引起的子宮內膜炎的作用[19,20]。后續我們可以使用SSA刺激穩定表達OXTR的細胞,通過檢測其下游信號通路的磷酸化水平來進一步判斷SSA通過激活OXTR進而發揮抗抑郁作用的具體機制。

鑒于中藥柴胡在治療抑郁中的巨大潛力,并且中藥具有比西藥不良反應少的優點,因此,闡明SSA的抗抑郁作用機制在抑郁癥的防治中有著極其重要的作用。G蛋白偶聯受體家族有800多個成員,幾乎參與調控了人體內所有的病理、生理過程,針對OXTR研究SSA是否以其為作用靶標及相關的細胞信號傳導通路,為抑郁癥等精神疾病的臨床研究治療和新藥開發提供必要的理論與參考依據。