硫酸化制備圓苞車前子低黏多糖及其結構表征和抗氧化活性研究

曹 磊,劉 偉,王俊龍,納森巴特,巴哈爾古麗·別克吐爾遜,松布爾,馮亞萍,熱合巴提·努爾夏提

伊犁師范大學化學化工學院 新疆維吾爾自治區教育廳天然產物化學與應用重點實驗室,伊寧 835000

多糖大量存在于動物、植物以及微生物中,由于其較低的毒性、優良的生物活性,在食品和醫藥行業廣泛應用。現代研究表明,多糖具有免疫調節、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗輻射、降血糖、降血脂、保肝等多種功能[1-4]。近年來,為了提高多糖的生物活性和優化多糖的理化性質,人們開發了多種多糖衍生方法,如硫酸化、乙酰化、羧甲基化和磷酸化等[5-7]。多糖的硫酸化可以顯著增強多糖的結構特征,提高多糖的生物活性,甚至使多糖具有新的生物活性[8]。Yang等[8]研究利用氯硫酸-吡啶法對納豆多糖進行硫酸化,硫酸化后的納豆多糖的抑菌活性有所增強。Chen等[9]采用氯硫酸-吡啶法制備硫酸化山藥多糖衍生物,結果表明硫酸化修飾優化了山藥多糖理化性質,表現出更加優異的免疫調節活性。Arokiarajan等[6]通過對海藻多糖的硫酸化修飾,提高了多糖在水中的溶解度,并進一步提高了多糖的提取率。生物結構化合物生物活性的決定性因素,Tao等[10]利用氯磺酸-吡啶法將天然菌類多糖硫酸化衍生物在體內和體外的抗腫瘤活性進行了對比,發現硫酸化衍生物對HepG2細胞的體外抑制率高于原多糖。

圓苞車前子為車前屬植物圓苞車前子(PlantagoovataForsk)的干燥成熟種子[11],是中國新疆地區食用和藥用的傳統藥用植物。圓苞車前子具有止瀉,利尿,止痛,降熱,消腫利咽等功效,主治腎炎水腫,泌尿系統感染,尿頻,尿痛,尿血,瀉痢等疾病[12]。圓苞車前子多糖具有高黏的特性,雖然賦予了其潤腸通便、促進腸道健康等生理功能,但也給其生產,研究和應用帶來了不便。這一問題一直受到廣泛關注,但進展緩慢。因此,有必要開發新的方法,在保證低成本,保結構,保活性的前提下,有效降低圓苞車前子多糖的黏度,以促進圓苞車前子多糖的進一步開發利用,提高經濟效益。到目前為止,還沒有研究報道圓苞車前子多糖的結構修飾及其對生物活性和結構特征的報道。

因此,本研究主要以圓苞車前子多糖為研究對象,以硫酸化方法制備低黏性圓苞車前子多糖,再經分離純化制備均一多糖,并初步研究其結構特征,采用體外抗氧化實驗評價其抗氧化活性。據我們所知,這是首次對圓苞車前子多糖的硫酸化降低黏性的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

圓苞車前子購自新疆恩薩爾維吾爾醫飲片藥業有限公司(批號:201902);乙二胺四乙酸(EDTA)(批號:P2369889,含量≥99%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);透析膜(批號20230615,3 500 kDa,美國BioSharp公司);無水二甲基亞砜(批號:H2211118,含量≥99%,北京索萊寶生物科技有限公司);碳化二亞胺鹽酸鹽(批號:A2314104,含量≥98%,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);間羥基聯苯(批號:J2215393,含量≥97%,北京索萊寶生物科技有限公司);Superdex凝膠系列(批號:10341428,含量≥99%,北京英萊克科技發展有限公司);DPPH(批號:D4313,含量≥99%,北京索萊寶生物科技有限公司);ABTS(批號:718T036,含量≥99%,北京索萊寶生物科技有限公司);剛果紅(批號:P1645856,含量≥99%,北京索萊寶生物科技有限公司);DMF(批號:P52452225,含量≥98%,北京索萊寶生物科技有限公司);右旋糖酐標準品(5、25、50、80、150和410 kDa)(批號:SM9530,含量≥98%,北京英萊克科技發展有限公司);三氧化硫吡啶配合物(SO3.Pyr)(批號:20220305,含量≥97%,北京索萊寶生物科技有限公司);DEAE-650 M(批號:0043201,含量≥99%,日本TOSHO公司);BCA試劑盒(批號:23227,含量≥99%,賽默飛世爾科技);其他試劑均為國產分析純。

1.2 實驗儀器

分析型高效液相(LC-20A,島津);氣相色譜儀(GC-2014C,島津);傅里葉變換紅外光譜儀(NICOLET6700,美國Thermo Fisher Scientific公司);酶標儀(Spectra Max M5,美國賽默飛世爾科技公司);黏度計(NDJ-5S,上海平軒科學儀器有限公司);能量色散X射線儀(E-1045,日立,日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 圓苞車前子的前處理

圓苞車前子原料在60 ℃下通風干燥24 h后,用萬能粉碎機粉碎,40目篩網過篩。先用石油醚在60 ℃下脫脂4 h,再用85%乙醇萃取4 h,去除色素、小分子、單糖和低聚糖。最后,將過濾后的殘渣收集起來,在50 ℃下干燥,得到預處理后的圓苞車前子。

1.3.2 圓苞車前子粗多糖的制備

采用課題組前期優化方法[13],取50 g預處理后的圓苞車前子,采用堿提法提取圓苞車前子多糖,提取條件:NaOH濃度為0.1 mol/L,料液比1∶40,提取溫度70 ℃,每次1 h,提取兩次,將兩次的提取液合并,減壓濃縮至1/2體積,在上清液中緩慢加入冰乙醇,當乙醇濃度達到80%時,出現大量的沉淀,離心保留沉淀組分,沉淀復溶于蒸餾水,純水中透析36 h,冷凍干燥得到圓苞車前子粗多糖(PlantagoovataForsk polysaccharide,POFP)。

1.3.3 圓苞車前子多糖的硫酸化修飾

POFP的硫酸化修飾采用氯硫酸-吡啶法進行[14]。50 mL圓底燒瓶中加入10 mL無水吡啶,在冰水浴環境下緩慢加入5 mL氯磺酸溶液,并不斷攪拌,得到淡黃色酯化試劑,現配現用。取100 mg POFP置于50 mL梨形瓶中,加入10 mL DMF,充分攪拌,得到POFP懸濁液。將酯化試劑在冰水浴條件下緩慢滴加到POFP懸濁液中(30 min中內加完),在80 ℃下反應3h。反應結束后,冷卻至室溫,加入1 mol/L氫氧化鈉溶液中和,最后,用蒸餾水透析(Mw截止=3 500 Da)36 h,冷凍干燥得到硫酸化多糖(sulfatedPlantagoovataForsk polysaccharide,POFP-S)。

1.3.4 多糖黏度測試

利用旋轉黏度分別以轉速(12、30、60 r/min)對硫酸化前多糖POFP與硫酸化后的多糖POFP-S的黏度進行測定。

1.3.5 POFP-S的分離純化

采用DEAE-650M纖維素柱(26.6 mm × 126 mm)對POFP-S進行分離。用NaCl(0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mol/L)梯度洗脫,流速為1 mL/min。用自動收集器收集洗脫液,用苯酚-硫酸法檢測多糖,收集多糖峰,透析(3 500 Da)。分離后多糖進一步用Superdex 200凝膠柱(16 mm×700 mm)進行純化,以超純水為溶劑,0.4 mL/min流速洗脫,收集多糖峰,冷凍干燥得到純化的圓苞車前子多糖,命名為POFP-S1、POFP-S2。

1.3.6 化學組成分析

1.3.6.1 硫酸基取代度的測定

取代度(degree of substitution,DS)是指多糖中每個單體單元的取代數。采用元素分析方法測定POFP-S1、POFP-S2的硫酸基取代度[15,16]。簡單地說,POFP-S1、POFP-S2采用能量色散X射線儀進行元素分析。POFP-S1、POFP-S2的DS根據EDX結果計算,計算公式如下。

(1)

式中,c為硫元素含量(%)。

1.3.6.2 其他化學成分測定

以葡萄糖為標準品,采用苯酚-硫酸法測定中性糖含量[17]。以半乳糖醛酸為標準品,采用四硼酸鈉-硫酸法測量糖醛酸含量[18]。以牛血清蛋白為標準品,采用BCA試劑法測定蛋白質含量[19]。

1.3.7 分子量測定

POFP-S1、POFP-S2的分子量(Mw)用分析高效液相色譜法[20]進行測定。準確配制2.0 mg/mL 多糖溶液,以水為流動相,上樣量為10 μL,色譜柱型號為TSK-gel G 3 000 PWXL(300 mm× 7.8 mm,7 μm),檢測器為RID-10A示差檢測器,流速為0.6 mL/min。采用T-dextran(5、25、50、80、150、410 kDa和藍色葡聚糖)為標準品,以保留時間為X軸,分子量的對數為Y軸,建立標準曲線,將多糖樣品帶入標準曲線中測定相對分子量。

1.3.8 單糖組成分析

單糖衍生物制備:取5 mg 多糖樣品置于10 mL 頂口瓶中,加入5 mL 2 mol/L三氟乙酸(TFA),于115 ℃水解6 h。冷卻至室溫,加入4 mL甲醇,用旋轉蒸發儀除去溶劑(重復3～5次)。隨后,加入8 mg鹽酸羥胺和0.5 mL的吡啶在90 ℃反應30 min。反應結束后,冷卻至室溫,再加入0.5 mL乙酸酐90 ℃反應40 min,冷卻后,氮吹儀吹干,加入1 mL二氯甲烷,過濾膜(0.45 μm),至氣相小瓶中供分析。單糖標準品無需酸解,其他步驟同樣品處理。結果與單糖標準品保留時間比對得出單糖組成[21]。

分析條件:采用配備色譜柱(Vondacap df=0.25 μm,X=30 mm)和氫火焰檢測器的氣相色譜儀,檢測器溫度為250 ℃,進樣量為3 μL,分流比為1∶70,載氣流量:氫氣,30 mL/min;氮氣,30 mL/min;空氣,150 mL/min。

1.3.9 紫外可見光譜測定

配制0.5 mg/mL的POFP-S1和POFP-S2的樣品10 mL,利用紫外可見分光光度計在200～400 nm之間測定樣品的紫外吸收。

1.3.10 紅外光譜測定

稱取1.0 mg完全干燥的多糖樣品,與100 mg完全干燥的KBr粉末在瑪瑙研缽中研磨均勻,后壓片,用傅里葉變換紅外光譜儀進行紅外掃描,掃描范圍4 000～400 cm-1。

1.3.11 剛果紅螺旋結構測定

POFP-S1、POFP-S2的三螺旋構象采用剛果紅法進行檢測[22],在試管中共加入2 mL水和2 mL 91 μmol/L剛果紅溶液,并加入2 mL不同濃度的氫氧化鈉溶液(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.8 mol/L)。同時,按照上述步驟,以2 mL水代替氫氧化鈉作為空白對照。在400～700 nm處測定最大吸收波長。以最大吸收波長為縱坐標,以氫氧化鈉濃度為橫坐標,繪制剛果紅實驗曲線。

1.3.12 X射線衍射分析(XRD)

采用X射線衍射技術研究了POFP-S1、POFP-S2的分子結晶特性。方法:取適量多糖樣品,在室溫下用X射線衍射儀掃描一定范圍內的衍射峰,掃描條件為:步長:0.01;速度:0.1 s/步。

1.3.13 抗氧化活性研究

1.3.13.1 DPPH自由基清除實驗

采用Hu等[23]的實驗方法稍作更改,取POFP-S1、POFP-S2(10 mg/mL)分別稀釋至10、5、2.5、1.25、0.625和0.312 5 mg/mL,分別等體積加入0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液,混勻,室溫下避光反應30 min。反應結束后取200 μL于96孔板中利用酶標儀在517 nm處測定其吸光度。以普魯蘭多糖為陽性對照(10、5、2.5、1.25、0.625和0.312 5 mg/mL),以水為空白對照。按照公式(2)計算DPPH自由基清除率。

(2)

式中,A1為DPPH與乙醇溶液的吸光度,A2為DPPH與多糖溶液的吸光度,A3為多糖與乙醇溶液的吸光度。

1.3.13.2 ABTS自由基清除實驗

取300 μL POFP-S1、POFP-S2(10 mg/mL)分別稀釋至10、5、2.5、1.25、0.625和0.312 5 mg/mL,分別加入3倍體積的0.2 mmol/L ABTS溶液,混勻,室溫下避光反應10 min。反應結束后取200 μL于96孔板中利用酶標儀在730 nm處測定其吸光度。以普魯蘭多糖為陽性對照(10、5、2.5、1.25、0.625和0.312 5 mg/mL),以水為空白對照。按照公式(3)計算ABTS自由基清除率。

(3)

式中,A1為水與ABTS溶液的吸光度,A2為樣品與ABTS溶液的吸光度,A3為水與多糖溶液的吸光度。

1.3.13.3 OH自由基清除實驗

取300 μL POFP-S1、POFP-S2(10 mg/mL)分別稀釋至10、5、2.5、1.25、0.625和0.312 5 mg/mL,分別加入240 μL的6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和等體積的6 mmol/L的FeSO4240 μL,混勻后加入0.1% H2O2(400 μL),37 ℃水浴孵化30 min。反應結束后取 200 μL反應液于96孔板中,利用酶標儀在510 nm處測定其吸光度。以普魯蘭多糖為陽性對照(10、5、2.5、1.25、0.625和0.312 5 mg/mL),以水為空白對照。按照公式(4)計算OH自由基清除率。

(4)

式中,A1為水與H2O2溶液的吸光度,A2為樣品與H2O2溶液的吸光度,A3為水與多糖溶液的吸光度。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 硫酸化多糖黏度測試

多糖黏度變化如圖1所示。由圖1我們可以發現POFP具有極大的黏度,隨轉速的提高多糖的黏度有所減少,POFP-S黏度有較大的改變,當轉速為12 r/min時,POFP-S的黏度相較于POFP降低約80%;當轉速提高到30 r/min時,多糖的黏度由355 Pa·s降至50 Pa·s,降低約85%,在轉速達到60 r/min時多糖黏度達到最低值20 Pa·s,較POFP降低約90%,實驗結果表明通過硫酸化修飾可以有效的降低圓苞車前子多糖的黏度。

圖1 多糖黏度測定結果

2.2 POFP-S 的分離純化

根據DEAE-650M色譜柱的洗脫曲線(見圖2),得到了兩個主要峰,其中第一個峰為水洗脫中性圓苞車前子多糖(POFP-S1),最后一個峰為0.8 mol/L氯化鈉洗脫的酸性多糖(POFP-S2)。收集了這兩個主要峰,利用Superdex 200柱進一步純化。如圖3、圖4所示,得到了兩個均一的圓苞車前子硫酸化多糖POFP-S1和POFP-S2。

圖2 POFP-S的DEAE-650M洗脫曲線

圖3 POFP-S1的凝膠純化曲線

圖4 POFP-S2的凝膠純化曲線

2.3 化學成分測定

POFP-S1、POFP-S2的化學成分及分子量如表1所示,POFP-S1中性糖含量為56.46%,硫酸基含量為17.55%;POFP-S2中性糖含量為66.41%,硫酸基的含量為38.09%,兩種多糖在蛋白含量測定實驗中均未檢測到蛋白;POFP-S1多糖的分子量較大,為3 556.0 kDa,POFP-S2多糖的分子量為833.7 KDa。如圖5所示,兩種多糖的純度較高分別為94.20%、98.89%。

表1 POFP-S1、POFP-S2中性糖、蛋白質、糖醛酸、硫酸基含量、取代度及其分子量

圖5 POFP-S1、POFP-S2高效液相色譜圖

2.4 單糖組成分析

如表2和圖6所示,POFP-S1主要由鼠李糖(rhamnose,Rha)、阿拉伯糖(arabinose,Ara)、木糖(xylose,Xyl)、葡萄糖(glucose,Glu)組成(7.58∶21.67∶67.66∶3.09),POFP-S2主要由Ara和Xyl組成(35.27∶64.73),其中POFP-S1和POFP-S2中Xyl、Ara為主要單糖成分。

表2 POFP-S1、POFP-S2的單糖組成

圖6 POFP-S1、POFP-S2的單糖組成分析

圖7 標準品的單糖分析氣相圖

2.5 紫外可見光譜解析

POFP-S1、POFP-S2的紫外可見光譜如圖8所示,譜圖顯示,POFP-S1、POFP-S2的吸收平滑,只在260 nm處有較高的吸收峰,這是由于硫酸基的n-π躍遷導致[20]的,進一步說明了POFP硫酸化成功;并且在280 nm處沒有吸收,再次說明硫酸化后的多糖沒有蛋白成分。

圖8 POFP-S1、POFP-S2紫外吸收光譜圖

2.6 紅外光譜分析

圓苞車前子硫酸化多糖POFP-S1、POFP-S2的紅外光譜如圖9所示。3 439 cm-1和2 927 cm-1處的強且寬的吸收峰歸屬為多糖上O-H,是多糖常見的特征吸收峰[24]。1 734 cm-1處有強吸收峰,是C=O 伸縮震動的特征吸收峰[25],表明樣品中含有糖醛酸結構。810 cm-1處和在1 249 cm-1處的吸收峰分別是C-O-S、S=O基團的伸縮震動峰,這兩處的伸縮震動也是硫酸化多糖的特征吸收峰[7],并且可以觀察到POFP-S2與POFP-S1在這兩個位置的吸收峰面積有較大差別,可能與硫酸化程度有關,并且與硫酸基取代度的結果一致。

圖9 POFP-S1、POFP-S2紅外光譜圖

2.7 三螺旋結構測定

多糖的活性與它的三螺旋結構具有密不可分的關系[13]。剛果紅實驗結果如圖10所示,我們發現POFP-S2的最大吸收波長隨著NaOH濃度的增大而紅移,表明多糖與剛果紅試劑形成了絡合物,而在NaOH濃度達到0.4 mol/L時出現了明顯的藍移,可能是由于NaOH濃度過高破壞了多糖螺旋結構形成了單鏈結構[26]。然而,POFP-S1和空白對照水一直呈現藍移,表明POFP-S1不具備三螺旋結構。

圖10 多糖三螺旋結構測定曲線

2.8 X射線衍射分析(XRD)

多糖的X射線衍射如圖11所示,可以看出當2θ約為18°、30°、41°時均出現了尖銳且強烈的峰,這是由于多糖的晶體結構所導致的,并且在圖中也可以發現存在較為平緩的部分,這也證明多糖具有非晶體結構。因此可以推斷出 POFP-S1、POFP-S2多糖是晶體與非晶體結合所形成的具有特殊結構的多糖分子。相較于未硫酸化POFP多糖[13],硫酸化的多糖也顯示出了其特殊的晶體結構。

圖11 POFP-S1、POFP-S2 XRD曲線

2.9 抗氧化活性分析

2.9.1 DPPH自由基的清除

對DPPH自由基的清除是鑒別物質體外抗氧化能力的一種常用方法[27]。如圖12所示,POFP-S1與POFP-S2對DPPH自由基的清除能力與濃度并不存在特殊的線性關系,清除能力隨濃度的增加呈先增加后減少再增加的趨勢,POFP-S1、POFP-S2在濃度為5 mg/mL時對自由基的清除均達到最大值。并且通過對比陽性對照,發現多糖POFP的清除能力高于Pullulan多糖。

圖12 多糖對DPPH自由基的清除能力

2.9.2 ABTS自由基的清除

硫酸化多糖對ABTS自由基的清除結果如圖13所示,多糖的清除能力與其濃度呈正相關,隨著濃度的增加多糖的自由基清除能力增強,對比陽性對照,POFP對ABTS的清除能力強于普魯蘭多糖,并且可以觀察到多糖POFP-S1在ABTS自由基的清除上具有顯著優勢,當濃度達到5 mg/mL時,POFP-S1的清除能力達到最大值41.8%。

圖13 多糖對ABTS自由基的清除能力

2.9.3 OH-自由基的清除

多糖對OH-自由基的清除結果如圖14所示,當POFP-S2的濃度達到1.25 mg/mL時達到清除率的最大值。相較于對ABTS自由基的清除,兩種多糖的清除能力發生改變,但相較于普魯蘭多糖有了較大提升,并且在低濃度時普魯蘭多糖并沒有明顯的清除能力。結果也表明POFP-S2對OH-自由基的清除能力強于POFP-S1的清除能力,這可能是由于POFP-S2具備更高的糖醛酸含量及硫酸基含量導致的。

圖14 多糖對OH-自由基的清除能力

3 結論

鑒于圓苞車前子多糖高黏特性無法進行純化及活性檢測,本文以硫酸化法對圓苞車前子多糖(POFP)進行硫酸化修飾,修飾后的多糖黏性大幅降低。通過對POFP-S分離純化,制備了兩種均一多糖,其中POFP-S1的多糖、糖醛酸、硫酸基的取代度及其純度分別為38.96%、2.91%、0.364、94.20%;POFP-S2的多糖、糖醛酸以及硫酸基的取代度分別為52.55%、3.68%、1.080、98.89%,兩種多糖均未檢測到蛋白質;其中,POFP-S1具有較大的分子量和較豐富的單糖組分。紫外(UV)、紅外光譜(FT-IR)發現POFP-S1和POFP-S2均具有典型的硫酸化多糖特征吸收峰,表明硫酸化修飾的成功;X射線衍射(XRD)及剛果紅實驗發現POFP-S2均具晶體與非晶體共存的,具特殊螺旋結構的多糖。在抗氧化方面,POFP-S1多糖對DPPH,ABTS自由基的清除能力相較于POFP-S2更強,這可能與其具有較大的分子量和其單糖組成(葡萄糖)有關,而對羥基自由基的清除中POFP-S2的清除能力較強,這可能是由于POFP-S2多糖中硫酸基的取代度較大有關。本研究為進一步研究圓苞車前子多糖的結構與活性提供文獻依據,以及開發具有潛力的藥食同源產品提供理論依據,為多糖的硫酸化研究提供思路。