黃姜花花的化學成分、抗氧化、酶抑制活性及抗炎作用研究

丁芙蓉,賈小演,吳相歡,吳 霞,楊 念,劉雄利,田民義*

1貴州大學釀酒與食品工程學院;2貴州大學生命科學學院;3西南藥食兩用資源開發利用技術國家地方聯合工程研究中心,貴陽 550025

黃姜花(HedychiumflavumRoxb.)為姜科姜花屬植物,具有食用、藥用和觀賞價值,主要分布于我國貴州、四川、西藏、云南、廣西等地,也在緬甸、泰國和印度被廣泛種植[1,2]。貴州畢節地區稱黃姜花為草果,是一種當地特色食品?，F有研究表明,黃姜花根狀莖具有多種藥理作用,如抗炎、抗菌、抗真菌、抗癌、殺蟲和酶抑制活性等[2-4],被用作食物調味料和中藥[5-6],它的嫩芽被用作調味品和蔬菜。黃姜花的花可作為食品調味料,其香氣濃郁且易揮發,人們為了使腌制品中增添濃郁的清香味,常將其添加到剁椒和辣椒醬中,同時新鮮的花瓣可作為炒菜的佐料。黃姜花的花浸膏用于調合香精[7]。此外,黃姜花的花有健胃止痛,溫中散寒的作用,常用于治療消化不良、腹瀉、胃寒腹痛、食積停滯等相關疾病[6,8]。黃姜花的花揮發油可在化妝品中使用,有芳香健胃的作用[6]。課題組前期的研究表明黃姜花的花揮發油具有顯著的體內外抗炎作用[9]。目前國內對黃姜花花的研究較少,其花非揮發性物質的化學成分和藥理活性尚未有報道。所以本實驗主要研究黃姜花花提取物的化學成分、抗氧化活性、酶抑制活性和抗炎活性。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品采購于2019年4月,產自廣西貴港,由貴州大學植物學專家胡國雄教授鑒定為姜科姜花屬黃姜花(HedychiumflavumRoxb.)的花,標本(編號:HF-20190421)保存于貴州省藥食同源植物資源開發工程技術研究中心。RAW 264.7細胞(中國科學院昆明細胞庫)。無水硫酸鈉和無水乙醇(色譜純,山東維進化工公司);MTT(98%,批號:530R0511)、二丁基羥基甲苯(BHT)(純度98%,批號:BCBV3237)、2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)(純度98%,批號:SLCH3887)、酪氨酸酶(批號:SLCG8506)、L-酪氨酸(98%,批號:VD223127)、熊果苷(純度98%,批號:A1026A025)、α-葡萄糖苷酶(批號:G7352E90B)、4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(純度99%,批號:H1909087)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH,純度98%,批號:STBH7297)、阿卡波糖(純度98%,批號:J1824027)、乙酰膽堿酯酶(批號:SLCJ4242)(德國Sigma公司);胎牛血清(批號:22110705,杭州四季青生物公司);丁酰膽堿酯酶(批號:SLCF8252,上海星科生物公司);PGE2ELISA試劑盒(批號:PEQBP5RT2B,中國臺灣Abnova公司);TNF-αELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒(批號:A28221056、A20611035,杭州聯科公司);IL-1βELISA試劑盒(批號:20221206,泉州睿信生物公司);二甲基亞砜(DMSO)(分析純,批號:20220920)、地塞米松(純度98%,批號:104J054)、脂多糖(LPS)(純度99%,批號:622P022)(北京索萊寶公司);高糖DMEM和雙抗(批號:8122757、192814,北京鼎國昌盛生物公司);碘代乙酰膽堿(批號:C10120826,上海晶抗生物公司);加蘭他敏(純度98%,批號:324E021,上海源葉生物科技有限公司);其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 提取物的制備

將新鮮黃姜花的花洗凈后粉碎,置于圓底燒瓶(2 L)中,加入蒸餾水(或70%乙醇)采用回流提取法進行提取(2 h)后抽濾,重復操作2次。將兩次收集的濾液混合后濃縮,濃縮液冷凍干燥得水提物和醇提物。

1.2.2 總酚酸總黃酮含量測定

1.2.2.1 總酚酸含量測定

總酚酸含量采用福林酚法(Folin-Ciocalteu)[10]測定。樣品溶液(0.5 mL)中加入福林酚試劑(2.5 mL)孵育4 min,然后加入碳酸鈉溶液(2 mL,7.5%),孵育60 min后測定其吸光值,測定波長為760 nm。以試劑為空白參比,沒食子酸為對照品建立坐標軸,繪制標準曲線。以每克樣品相當于多少毫克的沒食子酸表示總酚含量(mg GAEs/g sample)。

1.2.2.2 總黃酮含量測定

總黃酮含量采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法(NaNO2-Al(NO3)3-NaOH)[11]測定。樣品溶液(5 mL)中加入亞硝酸鈉溶液(0.4 mL,5%),孵育6 min,加入硝酸鋁溶液(0.4 mL,10%)孵育6 min,加入氫氧化鈉溶液(4 mL,4%)后再加入蒸餾水使總體積為10 mL,孵育15 min后測定其吸光值,測定波長為510 nm。以試劑為空白參比,蘆丁為對照品建立坐標軸,繪制標準曲線。以每克樣品相當于多少毫克的蘆丁表示總黃酮含量(mg REs/g sample)。

1.2.3 化學成分分析

采用超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱串聯質譜(UHPLC-Q-Orbitrap MS)分析提取物化學成分。液相系統:Dionex Ultimate 3000 RSLC(HPG)。流動相:乙腈(含0.1%甲酸)和0.1%甲酸水;進樣體積5 μL;流速0.3 mL/min;柱溫:40 ℃;色譜柱:ACE Ultracore 2.5 Super C18柱(100 mm×2.1 mm,1.9 μm)。梯度洗脫程序:0～2 min,5%A;2～42 min,5%→95%A;42～47 min,95%A;47～47.1 min,95%→5%A;47.1～50 min,5%A。質譜系統:Thermo Scientific Q Exactive Focus,熱噴霧離子源HESI-II。離子源參數:噴霧電壓3.0 kV(+)/2.5 kV(-);鞘氣35 arb;毛細管溫度320 ℃;輔助氣10 arb;擋錐氣0 arb;探頭加熱器溫度 350 ℃。質譜掃描參數:掃描方式為Full MS-ddMS2;分辨率為70000(Full MS)和17500(MS/MS);掃描范圍為100～1500m/z;最大駐存時間為100 ms(Full MS)和50 ms(MS/MS);AGC目標為1e6(Full MS)和2e5(MS/MS);最小AGC目標為8e3。質譜數據使用Xcalibur 4.1(美國賽默飛世爾科技公司)處理,并通過mzVault和mzCloud數據庫進行比較鑒定,允許相對質量偏差設置為10×10-6。

1.2.4 抗氧化活性測定

1.2.4.1 清除DPPH自由基能力測定

參照Zhai等[12]的方法進行本實驗,實驗組(As):2 mL樣品溶液與2 mL DPPH溶液;樣品空白組(Ar):2 mL樣品溶液與2 mL溶劑;溶劑空白組(A0):2 mL溶劑與2 mL DPPH溶液;以上三組于避光室溫下孵育30 min后測量吸光值(波長517 nm)。BHT為陽性對照,結果以每克樣品相當于多少毫克的BHT(mg BEs/g sample)表示。按公式(1)計算DPPH自由基清除率(RC)。

Rc=(1-(As-Ar)/A0)×100%

(1)

1.2.4.2 清除ABTS自由基能力測定

本實驗參照Zhai等[12]的方法進行,實驗組(As):0.4 mL樣品溶液與4 mL ABTS工作液;樣品空白組(Ar):0.4 mL樣品溶液與4 mL溶劑;溶劑空白組(A0):0.4 mL溶劑與4 mL ABTS工作液;以上三組避光反應10 min后測量吸光值(波長734 nm)。BHT為陽性對照。結果以每克樣品相當于多少毫克的BHT(mg BEs/g sample)表示。ABTS自由基清除率按公式(1)計算。

1.2.5 酶抑制活性測定

1.2.5.1 膽堿酯酶抑制活性測定

參考Lu等[13]的方法,底物選擇碘代乙酰膽堿和硫代丁酰膽堿,陽性對照選擇加蘭他敏。樣品組(A1):樣品溶液(50 μL)中加入乙(丁)酰膽堿酯酶(10 μL,pH 8,0.5 U/mL),在4 ℃反應15 min。加入二硫代雙硝基苯甲酸(20 μL,2 mmol/L)和底物(20 μL,2 mmol/L),在37 ℃反應30 min。最后測量吸光值(波長405 nm)。樣品空白組(A2):按以上步驟將乙(丁)酰膽堿酯酶換成緩沖液(pH 8);陰性組(A3):按以上步驟將樣品溶液換成緩沖液(pH 8);空白組(A4):按以上步驟將乙(丁)酰膽堿酯酶和樣品溶液都換成緩沖液(pH 8)。結果以IC50值和每克樣品相當于多少毫克的加蘭他敏(mg GALAEs/g sample)表示。乙(丁)酰膽堿酯酶抑制率(RI)計算如公式(2)所示:

RI=[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100%

(2)

1.2.5.2 酪氨酸酶抑制活性測定

參考Lu等[13]的方法,底物選擇L-酪氨酸,陽性對照為熊果苷。樣品組(A1):樣品溶液(70 μL)中加入酪氨酸酶(100 μL,100 U/mL)并在37 ℃反應5 min。加入底物(80 μL,5.5 mmol/L)后在37 ℃孵育30 min。最后測定吸光值(波長492 nm)。樣品空白組(A2):按以上步驟將酪氨酸酶換成緩沖液(pH 6.8);陰性組(A3):按以上步驟將樣品溶液換成緩沖液(pH 6.8);空白組(A4):按以上步驟將酪氨酸酶和樣品溶液都換成緩沖液(pH 6.8)。結果以IC50值和每克樣品相當于多少毫克的熊果苷(mg AREs/g sample)表示。酪氨酸酶抑制率按公式(2)計算。

1.2.5.3α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

參考Lu等[13]的方法,底物選擇硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(p-NPG),陽性對照選擇阿卡波糖。樣品組(A1):將樣品溶液(30 μL)與α-葡萄糖苷酶(10 μL,0.8 U/mL)加入緩沖液(60 μL,pH 6.8)中,在37 ℃反應15 min。然后加入底物(10 μL,1 mol/L),在37 ℃反應15 min。最后加入碳酸鈉溶液(80 μL,0.2 moL/L)停止反應,測定吸光值(波長405 nm)。樣品空白組(A2):按以上步驟將α-葡萄糖苷酶換成緩沖液(pH 6.8);陰性組(A3):按以上步驟將樣品溶液換成緩沖液(pH 6.8);空白組(A4):按以上步驟將α-葡萄糖苷和樣品溶液都換成緩沖液(pH 6.8)。結果以IC50值和每克樣品相當于多少毫摩爾的阿卡波糖(mmol ACEs/g sample)表示。α-葡萄糖苷酶抑制率按公式(2)計算。

1.2.6 抗炎活性測定

1.2.6.1 細胞毒性測定

樣品溶液對RAW 264.7細胞系的細胞毒性作用通過MTT法進行評估[14]。在96孔板中加入100 μL RAW 264.7細胞(2×104個細胞/孔)培養24 h后,將溶解在二甲基亞砜(DMSO)中的樣品用DMEM培養基從500 μg/mL連續半倍稀釋至31.25 μg/mL,吸出舊培養基并加入100 μL樣品溶液培養24 h。加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)后培養4 h,去除上清液,加入150 μL二甲基亞砜后震蕩10 min,測量吸光值(波長490 nm)。

1.2.6.2 促炎癥介質和細胞因子釋放量測定

將RAW 264.7細胞用LPS誘導后取上清液,采用Griess法和ELISA試劑盒檢測樣品對上清液中NO、PGE2、TNF-α、IL-6和IL-1β含量的影響。在96孔板中加入100 μL RAW 264.7細胞(2×104個細胞/孔)培養24 h后,吸出舊培養基加入100 μL樣品溶液培養2 h,然后加入100 μL LPS(1 μg/mL)培養24 h,收集上清液。設定空白組(control,CON)、模型組(LPS)、陽性對照(地塞米松,DXM)和樣品組。根據NO試劑盒和ELISA試劑盒說明書檢測評估NO、PGE2、TNF-α、IL-6和IL-1β含量。

1.2.7 統計分析

2 結果

2.1 黃姜花花提取物總酚酸總黃酮含量測定

黃姜花花水提物和醇提物的產率分別為(0.93±0.04)%和(0.59±0.03)%,其總酚酸及總黃酮含量如圖1所示。水提物和醇提物的沒食子酸當量值分別為25.78±0.09 mg GAEs/g sample和34.04±0.83 mg GAEs/g sample;蘆丁當量分別為73.21±0.58 mg REs/g sample和41.51±0.72 mg REs/g sample。分析結果表明,醇提物總酚酸含量顯著高于水提物(P<0.01),水提物總黃酮含量顯著高于醇提物(P< 0.01)。

圖1 黃姜花花提取物的產率和總酚酸、總黃酮含量

2.2 黃姜花花提取物化學成分分析

從黃姜花花水提物中鑒定出42種化合物,含有7種酚類化合物和11種黃酮類化合物;從黃姜花花醇提物鑒定出50種化合物,包括9種酚類化合物和17種黃酮類化合物。兩種提取物一共分析鑒定出58種化合物(圖2、表1),其中,酚類化合物共有11種:丁香醛、大麥芽堿、香草酸、七葉亭、對羥基肉桂酸、橙黃決明素-6-O-葡萄糖苷、松柏醛、咖啡酸乙酯、阿魏酸乙酯、6-姜酚、去氫二異丁香酚,結構式見圖3A。黃酮類化合物共有18種:二氫田基黃苷、維采寧II、羅漢果黃素、楊梅苷、異槲皮苷、野黃芩苷、槲皮素-3-葡萄糖醛酸苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、水仙苷、槲皮素、槲皮甙、桑黃素、蘇木素、山柰酚、異鼠李素、異黃腐醇、香葉木素,其結構式見圖3B。酚類化合物代表(香草酸,6-姜酚)和黃酮類化合物代表(羅漢果黃素,槲皮素)的質譜裂解途徑如圖4～7所示。

表1 黃姜花花提取物的植物化學成分

圖2 黃姜花的花醇提物和水提物的UHPLC-Q-Orbitrap-MS色譜圖

圖3 黃姜花花提取物酚類和黃酮類化合物結構

圖4 香草酸的裂解途徑

圖5 6-姜酚的裂解途徑

圖6 羅漢果黃素的裂解途徑

圖7 槲皮素的裂解途徑

2.3 黃姜花花提取物的抗氧化活性

由表2可知,黃姜花花水提物和醇提物對DPPH和ABTS自由基都有較好的抗氧化活性。二者對DPPH自由基的IC50值分別為165.78±2.45 μg/mL和163.70±2.84 μg/mL,BHT當量分別為667.14±9.95 mg BEs/g sample和679.32±12.00 mg BEs/g sample;對ABTS自由基的IC50值分別為104.97±8.27 μg/mL和99.69±2.97 μg/mL,BHT當量為129.53±10.24 mg BEs/g sample和135.91±4.05 mg BEs/g sample。

表2 黃姜花花提取物的抗氧化活性

2.4 黃姜花花提取物的酶抑制活性

由表3可知,黃姜花花提取物對α-葡萄糖苷酶、酪氨酸酶、乙(丁)酰膽堿酯酶有一定的抑制作用,水提物的陽性當量值分別為0.09±0.01 mmol ACEs/g sample、2.62±0.16 mg AREs/g sample、0.05±0.006 mg GALAEs/g sample和0.93±0.13 mg GALAEs/g sample;醇提物的陽性當量值分別為0.22±0.04 mmol ACEs/g sample、5.23±0.45 mg AREs/g sample、0.05±0.001 mg GALAEs/g sample和1.87±0.08 mg GALAEs/g sample。

表3 黃姜花花提取物的酶抑制活性

2.5 黃姜花花提取物的抗炎活性

2.5.1 黃姜花花提取物細胞毒性

如圖8所示,黃姜花花醇提物在500 μg/mL對RAW 264.7細胞表現出促增殖作用,黃姜花花水提物濃度在250 μg/mL及以下時對RAW 264.7細胞無毒性。與空白組相比,在黃姜花花醇提物和水提物的濃度范圍為31.25～250 μg/mL時對RAW 264.7細胞存活率的影響不顯著(P>0.05),所以后續試驗選擇濃度為62.5、125、250 μg/mL。

圖8 黃姜花花提取物對RAW 264.7細胞存活率的影響

2.5.2 黃姜花花提取物促炎癥介質和細胞因子釋放量測定

如圖9所示,將RAW 264.7細胞用LPS誘導后,模型組NO、PGE2、TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放量與空白對照相比顯著提高(P<0.05),使用提取物(62.5、125、250 μg/mL)預處理RAW 264.7細胞后,NO、PGE2、TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放量均低于模型組。尤其是濃度為250 μg/mL的醇提物對NO、PGE2、TNF-α和IL-6的影響均優于地塞米松(20 μg/mL),而對IL-1β的影響相當于地塞米松(20 μg/mL)。此外濃度為250 μg/mL的水提物對PGE2和IL-6的作用優于地塞米松(20μg/mL)。以

圖9 黃姜花花提取物對RAW 264.7細胞促炎介質和細胞因子釋放量的影響

上結果表明,黃姜花花提取物可顯著抑制LPS誘導的RAW 264.7細胞中促炎癥介質和細胞因子的釋放,并且呈劑量依賴性。

3 討論與結論

植物多酚和黃酮類化合物具有抗氧化、清除自由基、增強免疫力、抗菌消炎、改善心血管、保護肝臟、抗衰老、降血脂、抗癌等作用[15],而黃姜花花提取物總酚酸總黃酮含量較高,可以用作酚類和黃酮類的豐富來源。從黃姜花花提取物中共鑒定出58種化合物,包括11種酚類化合物和18種黃酮類化合物。黃姜花花提取物對DPPH和ABTS自由基都有較好的抗氧化活性,特別是對DPPH自由基的清除作用較強。在過去的研究中發現,植物提取物的總酚和類黃酮含量與其對DPPH和ABTS的清除能力呈正相關性[16,17],所以黃姜花花提取物較強的抗氧化能力與其較高的總酚酸和總黃酮含量密不可分。

黃姜花花醇提物和水提物都能顯著降低RAW 264.7細胞中促炎癥介質(NO和PGE2)和細胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的過度分泌,其中醇提物表現出更好的抗炎活性。據研究報道,松柏醛具有較好的抗炎作用,可減輕炎癥損傷[18];異槲皮苷可抑制TNF-α、NO、iNOS和COX-2的過度產生[19];槲皮素可降低炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β的釋放量[20];香葉木素具有抗炎作用[21]。以上化合物只存在于醇提物中,這些化合物可能是黃姜花花醇提物抗炎活性較好的原因。除此之外,兩種提取物都含有的丁香醛有抗炎作用[22];香草酸可抑制細胞因子的產生,用于治療炎癥[23];七葉亭可抑制炎癥相關介質合成,減輕炎癥反應[24,25];維采寧II可抑制細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β產生[26]。因此,黃姜花花提取物的抗炎作用可能與其中酚類和黃酮類化合物的生物活性相關。

綜上所述,黃姜花花水提物和醇提物含有較高含量的酚類和黃酮類化合物,有較好的抗氧化活性抑制能力和一定的酶抑制能力,同時表現出較好的抗炎作用。研究結果可為黃姜花的花在食品、藥品、化妝品等領域的開發利用提供理論基礎。