南五味子藥材UPLC指紋圖譜及一測多評法研究

劉曉霞,位翠杰,馮涌微,張芳平,段志文,謝文凱,何民友,李振雨

廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室,佛山 528244

南五味子為木蘭科植物華中五味子SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.的干燥成熟果實[1]。其性溫,味酸、甘,具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功效,用于久嗽虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗盜汗、津傷口渴、內熱消渴、心悸失眠等證。南五味子主要化學成分為三萜類和木脂素類化合物。近年來研究表明南五味子具有保肝護肝、鎮靜催眠、抗腫瘤、降血糖、抗氧化及增強免疫力等作用,具滋補強壯之力,有很高的藥用和食用價值。

中藥的質量,直接關系到臨床治療的效果,有效控制中藥的質量,是保證中醫臨床療效的前提[2]。目前,指紋圖譜技術已被廣泛地應用到中藥質量控制中[3,4],它能較全面地表征中藥化學成分,具有特征性和全面性的特點[5],將指紋圖譜與一測多評法(QAMS)相結合從定性和定量角度全面控制中藥的質量,是中藥現代化的重要途徑[6]。目前,2020年版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱“《中國藥典》”)南五味子藥材項下以五味子酯甲為含量測定指標,但單一成分的含量測定已不能滿足中藥整體的質量控制理念。

目前,已有關于南五味子指紋圖譜的建立和化學成分的研究報道,如Guo等[7]采用高效液相色譜法(HPLC)建立了南、北五味子藥材指紋圖譜,結合化學模式識別分析,篩選出了4個影響南、北五味子藥材質量的差異標志物。Ma等[8]等采用HPLC法建立南五味子藥材指紋圖譜,并對指紋圖譜中的7個已知成分進行定量分析。Wei等[9]采用UPLC法建立了南五味子藥材指紋圖譜,并對五味子中的3種主要有效成分五味子甲素、安五脂素和五味子酯甲的含量進行測定。相較于普通液相色譜,超高效液相色譜的使用能夠縮短分析時間,提高色譜峰的分離度,在指紋圖譜的研究中優勢更為明顯,而上述研究面臨的共同問題是法定對照品的缺失以及對照品的過多使用帶來成本的上升,采用一測多評法用于南五味子藥材的質量控制研究仍未有報道。本次研究采用UPLC指紋圖譜和一測多評,結合化學計量學分析手段,對14批對南五味子藥材進行全面質量控制研究,既節省了對照品,又為全面、客觀、準確評價南五味子質量提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Themo Vanquish超高效液相色譜儀(賽默飛有限公司);ACQUITY HSS T3 C18色譜柱(2.1 mm×150 mm,1.8 μm);ME204E萬分之一天平(梅特勒-托利多公司);XP26百萬分之一天平(梅特勒-托利多公司);KQ-500DE數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與試藥

五味子酯甲(批號:111529-201706,含量:95.20%)、五味子甲素(批號:110764-201915,含量:99.50%)(中國食品藥品檢定研究院);五味子酯丙(批號:ST24450105,含量:98.0%)、安五脂素(批號:ST0 7390120,含量:98.0%)(上海詩丹德標準技術服務有限公司);五味子酯乙(批號:18092804,含量:98.0%,成都普菲德生物技術有限公司);五味子酯丁(批號:CFS202002,含量:98.0%,Chem Faces公司);液相用乙腈(色譜純,默克股份有限公司);水為超純水(實驗室自制);其余試劑皆為分析純。

1.3 藥材

本次實驗所用的南五味子藥材由廣東一方制藥有限公司采購管理部采收,經廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為木蘭科植物華中五味子SchisandrasphenantheraRehd.et Wils.的干燥成熟果實,14批南五味子產地信息見表1。

表1 南五味子藥材產地信息表

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件

采用Waters ACQUITY HSS T3(2.1 mm×150 mm,1.8 μm)色譜柱;以乙腈為流動相A,0.1%磷酸溶液為流動相B,梯度洗脫(0～10 min,2%→10%A;10～11 min,10%→51%A;11～26 min,51%→54%A;26～40 min,54%→95%A);流速為0.3 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測波長為230 nm;進樣量為1 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取原兒茶酸對照品適量,加甲醇制成每1 mL原兒茶酸85.926 μg的溶液,作為對照品溶液;另精密稱取五味子酯丙、五味子酯甲、五味子酯乙、安五脂素、五味子甲素和五味子酯丁對照品適量,加甲醇制成每1 mL含五味子酯丙58.252 μg、五味子酯甲98.589 μg、五味子酯乙102.116 μg、安五脂素97.334 μg、五味子甲素102.246 μg和五味子酯丁80.634 μg的混合溶液,即得。

2.1.3 供試品溶液的制備

取南五味子藥材粉末(過三號篩)約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70%乙醇50 mL,稱定重量,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)30 min,取出,放冷,再稱定重量,用70%乙醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。

2.1.4 指紋圖譜方法學考察

2.1.4.1 精密度試驗

取南五味子藥材供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6次,以五味子酯甲峰為參照峰S,計算各共有峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積及RSD值,相對保留時間RSD值在0.20%～0.96%范圍內,相對峰面積RSD值在0.06%～3.0%范圍內,表明儀器精密度良好。

2.1.4.2 重復性試驗

取同一份樣品(編號:N01,過三號篩)約0.5 g,按“2.1.3”項下方法制備6份供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件測定,以五味子酯甲峰為參照峰S,計算各共有峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積及RSD值,相對保留時間RSD值在0.070%～1.3%范圍內,相對峰面積RSD值在0.20%～2.1%范圍內,表明該方法重復性良好。

2.1.4.3 穩定性試驗

取“2.1.4.2重復性試驗”項下供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件,分別在0、2、5、7、12、18、24 h進行分析,以五味子酯甲峰為參照峰S,計算各共有峰與S峰的相對保留時間和相對峰面積及RSD值,相對保留時間RSD值在0.10%～2.2%范圍內,相對峰面積RSD值在0.14%～2.3%范圍內,表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.5 指紋圖譜的建立及共有峰標定

根據“2.1.1”項下色譜條件和“2.1.3”項下供試品溶液制備方法,對14批南五味子藥材進行指紋圖譜測定,記錄色譜圖,導出指紋圖譜CDF格式,并導入《中藥色譜指紋圖譜相似度系統(2012.130723版本)》,以編號N01樣品指紋圖譜為參照圖譜,時間窗寬度設定為0.1 min,進行多點校正和色譜峰匹配,14批南五味子藥材指紋圖譜共標識出15個共有峰,其疊加圖見圖1所示。采用中位數法生成南五味子藥材對照指紋圖譜(見圖2)。采用“2.1.3”項下對照品溶液對共有峰進行指認,通過與對照品保留時間和紫外-可見光3D光譜對比分析,確定峰1為原兒茶酸;峰5為五味子酯丙;峰6為五味子酯甲;峰7為五味子酯乙;峰11為安五脂素;峰13為五味子甲素;峰14為五味子酯丁(見圖3)。

圖1 14批南五味子藥材UPLC指紋圖譜

圖2 南五味子藥材對照指紋圖譜

圖3 共有指紋峰的指認

2.1.6 相似度評價

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度系統(2012.130723版本)》軟件計算14批南五味子藥材指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度(見表2),結果顯示,14批南五味子藥材指紋圖譜的相似度值在0.987～0.996,均在0.95以上,表明指紋圖譜可作為共性質量特征,用于南五味子藥材的鑒別和質量控制。

表2 相似度評價結果

2.1.7 化學計量學分析

2.1.7.1 聚類分析(HCA)

采用IBM SPSS Statistics 20.0軟件,以14批南五味子藥材指紋圖譜15個共有峰的峰面積為變量,采用Z得分法對峰面積進行標準化處理,樣本間距以平方Euclidean距離表征,以組間聯接法對14批南五味子藥材指紋圖譜進行聚類分析(見圖4)。結果顯示,組間距離為10～15時,14批南五味子藥材樣品分為四類,其中編號N01～N05的樣品歸為第一類;編號N06～N08的樣品歸為第二類,編號N09～N11的樣品歸為第三類,編號N12～N14的樣品歸為第四類,說明不同產地的南五味子藥材化學成分的含量存在一定的差異。

圖4 聚類分析圖

2.1.7.2 正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)

將14批南五味子樣品中各指紋峰的峰面積為變量,采用SIMCA 14.1軟件建立OPLS-DA模型,其中R2X=0.882,R2Y=0.953,Q2=0.919,均高于0.5,表明建立的模型穩定有效,可以用于不同產地南五味子的模式識別。通過OPLS-DA的Scores圖(見圖5)可知,不同產地南五味子藥材在模型中空間分布不同,也明顯分為4類。且對VIP值(見圖6)進行分析可知,共篩選出9個差異標志物,VIP>1.0的依次分別為峰1>峰6>峰12>峰8>峰2>峰4>峰15>峰9>峰7,說明該成分對區分不同產地南五味子藥材的貢獻較大,其中對峰1(原兒茶酸)對不同產地南五味子樣品分類有顯著影響。通過對14批南五味子藥材峰1(原兒茶酸)的峰面積結果分析,發現河南產地的3批南五味子藥材原兒茶酸含量最高,湖北次之,陜西、山西產地最低,這可能與藥材產地、加工方式等差異有關。

圖5 南五味子藥材的OPLS-DA分析Scores圖

圖6 南五味子藥材VIP圖

2.2 一測多評含量測定的建立

2.2.1 精密度試驗

精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液,按照“2.1.1”項下色譜條件重復進樣6次,記錄五味子酯丙、五味子酯甲、五味子酯乙、安五脂素、五味子甲素和五味子酯丁6種木脂素類成分的峰面積,并計算其RSD值均小于3.0%,表明儀器精密度良好。

2.2.2 線性關系考察

精密稱定五味子酯丙對照品6.586 mg、五味子酯甲對照品6.301 mg、五味子酯乙對照品7.332 mg、安五脂素對照品5.569 mg、五味子甲素對照品8.745 mg和五味子酯丁對照品7.146 mg,加甲醇制成每1mL含五味子酯丙258.171 μg、五味子酯甲239.942 μg、五味子酯乙287.414 μg、安五脂素218.305 μg、五味子甲素348.051 μg、五味子酯丁280.123 μg的混合溶液,即得對照品貯備液。精密移取上述對照品貯備液1、1、1、2、3 mL,分別置100、25、5、5、5 mL量瓶中,加甲醇制成系列濃度的混合對照品應用液;分別取上述混合對照品貯備液和混合對照品應用液,分別按“2.1.1”項下色譜條件依次進樣分析,記錄色譜峰面積,以峰面積為縱坐標(Y),對照品濃度為橫坐標(X),繪制標準曲線,結果見表3,結果顯示,各指標成分在相應的濃度內峰面積與對照品濃度線性關系良好。

表3 6種成分的線性回歸方程及線性范圍

2.2.3 重復性試驗

取同一份樣品(編號:N01,過三號篩)約0.5 g,共6份,精密稱定,按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析,計算五味子酯丙、五味子酯甲、五味子酯乙、安五脂素、五味子甲素和五味子酯丁6種木脂素類成分的峰面積,并計算其RSD值均小于3.0%,表明該方法重復性良好。

2.2.4 穩定性試驗

取南五味子藥材供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件,分別在0、2、5、7、12、18、24 h測定,計算五味子酯丙、五味子酯甲、五味子酯乙、安五脂素、五味子甲素和五味子酯丁6種木脂素類成分的峰面積,并計算其RSD值均小于3.0%,表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗

取已知含量測定的南五味子藥材粉末(編號:N01,過三號篩)約0.25 g,精密稱定,按樣品與對照品含量比為1∶0.5、1∶1及1∶1.5的比例加入五味子酯丙、五味子酯甲、五味子酯乙、安五脂素、五味子甲素和五味子酯丁6種木脂素類成分對照品,每種比例平行3份,按“2.1.3”項下方法制備9份供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析,計算6種成分的回收率及RSD值,結果見表4,五味子酯丙、五味子酯甲、五味子酯乙、安五脂素、五味子甲素和五味子酯丁6種木脂素類成分的加樣回收率范圍分別是99.27%～102.0%、97.20%～101.4%、98.41%～101.8%、97.20%～99.77%、98.74%～101.3%、98.36%～101.2%,RSD值均小于2.0%,表明該分析方法準確度良好。

表4 6種成分的加樣回收率結果

2.2.6 相對校正因子計算

以五味子酯甲為內標物,根據“2.2.2”項下線性考察結果,以對照品的濃度及其對應的色譜峰面積,分別計算內標物五味子酯甲與五味子酯丙、五味子酯乙、安五脂素、五味子甲素和五味子酯丁的相對校正因子,計算公式為fsi=fs/fi=Cs×Ai/(Ci×As),其中As為內標物s的對照品峰面積,Cs為內標物s的對照品濃度,Ai為其他成分i的對照品峰面積,Ci為其他成分i的對照品濃度。結果五味子酯丙的平均校正因子為1.22,五味子酯乙的平均校正因子為1.21,安五脂素的平均校正因子為2.57,五味子甲素的平均校正因子為1.05,五味子酯丁的平均校正因子為1.14,結果見表5。

表5 5種成分相對校正因子計算結果

2.2.7 系統適用性試驗

2.2.7.1 不同儀器考察

以五味子酯甲為參照,計算五味子酯丙、五味子酯乙、安五脂素、五味子甲素和五味子酯丁在不同品牌儀器上(Waters H-Class、Thermo Vanquish和Agilent 1290)的相對保留時間和相對校正因子,結果見表6。結果顯示,上述5種指標成分的相對保留時間RSD在0.00%～0.35%范圍內,相對校正因子RSD在0.25%～0.57%范圍內,表明不同儀器對五味子酯丙、五味子酯乙、安五脂素、五味子甲素和五味子酯丁的相對保留時間和相對校正因子無顯著影響。

表6 不同儀器下相對保留時間和相對校正因子測定結果

2.2.7.2 不同流速考察

以五味子酯甲為參照,計算五味子酯丙、五味子酯乙、安五脂素、五味子甲素和五味子酯丁在不同流速下(0.28、0.30、0.32 mL/min)的相對保留時間和相對校正因子,結果見表7。結果顯示,上述5種指標成分的相對保留時間RSD在0.06%～1.2%范圍內,相對校正因子RSD在0.41%～2.0%范圍內,表明不同流速對五味子酯丙、五味子酯乙、安五脂素、五味子甲素和五味子酯丁的相對保留時間和相對校正因子無顯著影響。

表7 不同流速下相對保留時間和相對校正因子測定結果

2.2.7.3 不同柱溫考察

以五味子酯甲為參照,計算五味子酯丙、五味子酯乙、安五脂素、五味子甲素和五味子酯丁在不同柱溫下(28、30、32 ℃)的相對保留時間和相對校正因子,結果見表8。結果顯示,上述5種指標成分的相對保留時間RSD在0.06%～0.23%范圍內,相對校正因子RSD在0.47%～1.7%范圍內,表明不同柱溫對五味子酯丙、五味子酯乙、安五脂素、五味子甲素和五味子酯丁的相對保留時間和相對校正因子無顯著影響。

表8 不同柱溫下相對保留時間和相對校正因子測定結果

2.2.8 色譜峰定位

取“2.2.7系統適用性”項下不同儀器、不同流速和不同柱溫的相對保留時間均值,確定五味子酯丙、五味子酯乙、安五脂素、五味子甲素和五味子酯丁的相對保留時間分別為0.97、1.0、1.2、1.3和1.40。

2.2.9 樣品測定

取14批南五味子藥材,按“2.1.3”項下供試品溶液制備方法和“2.1.1”項下色譜條件對14批南五味子進行測定,以五味子酯甲為參照,分別采用外標法(EMS)和一測多評法(QAMS)計算五味子酯丙、五味子酯乙、安五脂素、五味子甲素和五味子酯丁的含量,并比較兩種計算方式的相對偏差,結果見表9。結果顯示,兩種方法測定的五味子酯丙、五味子酯乙、安五脂素、五味子甲素和五味子酯丁的含量相對偏差均小于3.0%,說明兩種方法計算結果無顯著差異,QAMS準確度良好。根據外標法計算結果可知,湖北產地的5批南五味子藥材6種木脂素總含量最高,其余9批陜西、河南、山西產地的樣品含量較均勻,其中山西產地3批含量最低。

表9 14批南五味子藥材含量測定結果

3 討論與結論

2020年版《中國藥典》規定南五味子藥材在秋季果實成熟時采摘。有文獻報道,Li等[10]對湖北、四川、江西三個產區南五味子藥材中主要化學成分的含量變化進行研究,通過對測定結果分析,發現三個產區不同生長期的南五味子藥材中主要化學成分積累具有一定的規律;初步確定南五味子的最佳采收期為9月中下旬。Huang等[11]采用紫外分光光度法和液相色譜法,測定不同采收期陜西產南五味子中揮發油、總木脂素、五味子酯甲和五味子甲素的含量,結果認為南五味子最佳采收期在8月上旬為佳。此外,研究顯示,不同的產地加工方式對南五味子有效成分的含量有顯著影響[12]。本次研究發現,湖北產地的5批南五味子藥材6種木脂素總含量最高,其余9批陜西、河南、山西產地的樣品含量較均勻,其中山西產地3批含量最低;此外,原兒茶酸含量最高的則是河南產地,湖北次之,陜西、山西產地最低,這可能與藥材的產地、采收時間、加工方式等差異有關。

本研究采用UPLC建立南五味子藥材指紋圖譜,分別考察了不同流動相系統(甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸),結果顯示,采用乙腈-0.1%磷酸為洗脫系統,色譜峰的信息較全面,分離效果較好。采用二極管陣列檢測器(DAD檢測器)對南五味子藥材供試品溶液在190～350 nm范圍內進行全波長掃描,并提取不同波長(230、254 nm)下的指紋圖譜進行對比,結果顯示,在230nm下,指紋圖譜色譜峰的響應和色譜峰容量均較好。還考察了不同柱長[Waters ACQUITY HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)、Waters ACQUITY HSS T3(2.1 mm×150 mm,1.8 μm)]對南五味子藥材指紋圖譜各色譜柱的分離度,結果顯示,Waters ACQUITY HSS T3(2.1 mm×150 mm,1.8 μm)色譜柱分離度較好。此外,通過單因素分析,以“指紋圖譜總峰面積/稱樣量”及6種木脂素類成分的含量為評價指標,分別考察了提取溶劑、提取方式和提取時間對南五味子藥材指紋圖譜及含量測定的影響,確定最佳供試品溶液制備方法,使指紋圖譜各色譜峰提取效率達到最高。

目前,指紋圖譜相似度評價法、歐氏距離聚類分析法和主成分分析法等化學模式識別方法在中藥材質量、產地差異以及品種鑒別等研究領域的應用已較為廣泛[13-15]。本研究引入指紋圖譜相似度評價分析、聚類分析以及正交偏最小二乘法-判別分析,可以直觀衡量不同批次南五味子樣品間指紋圖譜變化模式的相似性及親疏程度。結果顯示14批南五味子藥材指紋圖譜與對照指紋圖譜相似度均在0.95以上,說明不同產地南五味子藥材有較好的一致性。通過聚類分析和正交偏最小二乘法判別分析,可將14批南五味子藥材分為4類,呈現一定的產地規律性;共篩選出9個差異性物質,分別為峰1(原兒茶酸)、峰2、峰4、峰6、峰7(五味子酯乙)、峰8、峰9、峰12、峰15,說明以上9個成分對南五味子指紋圖譜影響較大。有待進一步深入研究。本實驗利用南五味子木脂素類化合物結構的相似性,建立了采用QAMS法對南五味子藥材中的6種木脂素類成分的含量進行初步測定。此次研究選擇的五味子酯甲、五味子酯丙、五味子酯乙、安五脂素、五味子甲素和五味子酯丁成分在南五味子藥材具有一定的生物活性,可以反映藥材的內在質量。其中五味子酯甲化學性質穩定,作為內參物,具有一定的代表性。通過比較一測多評法(QAMS)和外標法的相對誤差,結果表明所建立的南五味子“一測多評”含量測定方法與外標法的測定結果無顯著性差異,表明建立的方法具有良好的可信度。

本研究采用指紋圖譜與一測多評相結合的手段,從定性、定量兩方面來評價南五味子藥材的質量,可為提升南五味子藥材質量標準提供參考。