核轉(zhuǎn)錄因子κB在慢性間歇低氧大鼠各臟器的表達(dá)及其介導(dǎo)的炎癥介質(zhì)變化

摘要 目的：觀察核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）在正常大鼠及慢性間歇低氧大鼠各臟器的表達(dá)差異及其信號通路介導(dǎo)的慢性間歇低氧大鼠機(jī)體多種炎癥介質(zhì)變化。方法：將30只雄性大鼠，隨機(jī)分為對照組及觀察組各15只。對照組常規(guī)飼料喂養(yǎng)，關(guān)燈睡眠；觀察組每日間歇缺氧7 h。8周后處死2組大鼠，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）檢測血清單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-8、C-反應(yīng)蛋白（CRP）。使用蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）分別檢測2組大鼠NF-κB的蛋白表達(dá)。結(jié)果：觀察組NF-κB表達(dá)較對照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01），MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP水平均較對照組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）。結(jié)論：炎癥介質(zhì)在慢性間歇低氧大鼠機(jī)體高表達(dá)，源于慢性間歇低氧引起的機(jī)體免疫紊亂，NF-κB介導(dǎo)的信號通路激活，介導(dǎo)了炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞 核轉(zhuǎn)錄因子κB；慢性間歇低氧；阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征；動(dòng)物模型；大鼠；炎癥介質(zhì)；信號通路

Abstract Objective：To observe the difference of NF-κB expression in normal rats and chronic intermittent hypoxia rats and the changes of inflammatory factors mediated by its signaling pathway in chronic intermittent hypoxia rats.Methods：Thirty male rats，They were randomly divided into normal control group and intermittent hypoxia group.Normal control group，routine feed feeding，Normal lights off sleep; intermittent hypoxia group daily intermittent hypoxia 7 h.After 8W，two groups of rats were killed，Using enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） to detect（chemokines-1） MCP-1、（tumor necrosis factor-α）TNF-α、（interleukin-6） IL-6、（interleukin-8）（C-reactive protein） CRP.The protein expression of NF-κB was detected by Western blotting method.The expression difference between the two groups was compared.Results：The expression of NF-κB in intermittent hypoxia group increased Plt;0.01 compared with that in control group.The average water of MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8 and other inflammatory factors was significantly higher than that of normal control group，Plt;0.01，the difference was significant，and the CRP inflammatory factor Plt;0.05，the difference was statistically significant.Conclusion：the high expression of inflammatory factors in chronic intermittent hypoxia rats is due to the immune disorder caused by chronic intermittent hypoxia and the activation of NF-κB mediated signaling pathway，which mediates the inflammatory response.

Keywords NF-κB；Chronic intermittent hypoxia；Obstructive sleep apnea syndrome；Inflammatory factor；Signal channel

中圖分類號：R766.3；R965文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.2095-7130.2023.05.073

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（Obstructive Sleep Apnea-hypopnea Syndrome，OSAHS）是臨床常見而又容易忽略的疾病，可引起多臟器損害，可并發(fā)原發(fā)性高血壓、糖尿病、冠心病、心腦血管意外等全身性疾病，其根本原因?yàn)橐归g的慢性間歇低氧引起的損害［1-3］。核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）是一種核轉(zhuǎn)錄因子，有觀點(diǎn)認(rèn)為OSAHS反復(fù)發(fā)作的呼吸暫停和低通氣可激活一系列炎癥相關(guān)機(jī)制，如慢性間歇缺氧條件下NF-κB的活化［4］。NF-κB與OSAHS之間的關(guān)系尚不十分明確。本研究觀察核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）在正常大鼠及慢性間歇低氧大鼠的表達(dá)差異及其信號通路介導(dǎo)的慢性間歇低氧大鼠機(jī)體多種炎癥介質(zhì)變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取廣東醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究實(shí)驗(yàn)中心提供標(biāo)準(zhǔn)SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量（210±20）g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號：SYXK（粵）2020-0034。所有大鼠均在正常環(huán)境中以普通飼料及飲用水喂養(yǎng)8周。

1.1.2 藥物 苯甲基磺酰氟（PMSF）裂解液（上海谷研實(shí)業(yè)有限公司，GOYK97200），10%水合氯醛（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號：mlsw-2012）。

1.1.3 試劑與儀器 間歇缺氧艙（間歇氧濃度控制系統(tǒng)，上海玉研科學(xué)儀器有限公司，型號：S1008），酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）血清單核細(xì)胞趨化蛋白-1試劑盒（MCP-1，上海化邦生物科技有限公司，貨號：HBP37057R）、腫瘤壞死因子-α試劑盒［TNF-α，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，貨號：T6674-10UG］、白細(xì)胞介素-6試劑盒（IL-6，上海化邦生物科技有限公司，貨號：HBP31372R）、IL-8試劑盒（上海化邦生物科技有限公司，貨號：HBP31375R）、C-反應(yīng)蛋白試劑盒（CRP，深圳瑞清生物信息科技有限公司，貨號：RQ-P-R0128，），十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒［（克拉瑪爾）上海譜振生物科技有限公司］，TBST洗滌緩沖液（深圳逗點(diǎn)生物技術(shù)有限公司，貨號：TBST-510），辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（南京沃博生物科技有限公司，貨號：A21020），超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒WB顯影液（南京江苑生物科技有限公司，貨號：JY01051）。

1.2 治療方法

1.2.1 分組與干預(yù)方法

按照簡單隨機(jī)化原則分為對照組和觀察組，每組15只，對照組正常關(guān)燈睡眠。觀察組大鼠放養(yǎng)于間歇缺氧艙內(nèi)，每日9：30—16：30開艙，每日共7 h，間歇向艙內(nèi)循環(huán)充入氮?dú)庵圃炻蚤g歇缺氧，8 min為一個(gè)循環(huán)，使艙內(nèi)氧濃度維持在8.5%～21%之間，以模擬阻塞性睡眠呼吸暫停呼吸時(shí)患者的缺氧狀態(tài)。直視下抽取大鼠腹主動(dòng)脈血檢測動(dòng)脈血?dú)夥治鲋笜?biāo)，直至提示達(dá)重度OSAHS表示造模成功。

1.2.2 檢測方法

暴露結(jié)束后，于第8周將各組大鼠心臟采血后注射10%水合氯醛麻醉后處死。血液4 ℃靜置、離心，上清液于-80 ℃凍存以備酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）檢測血清MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP含量。處死后迅速整取其肺臟、心臟及腦組織，并將取出組織于液氮中冷卻迅速凍存以備蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）檢測NF-κB蛋白的表達(dá)。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 1）ELISA檢測：稀釋標(biāo)準(zhǔn)品后，嚴(yán)格按ELISA說明書操作，在樣品孔中加入待檢炎癥介質(zhì)標(biāo)本，封板膜封板，4 ℃過夜。取出后室溫2 h，洗板；37 ℃室溫下加入一抗孵育2 h，反復(fù)洗滌清除殘留物；37 ℃室溫下加入二抗孵育2 h，再洗滌。避光顯色后終止反應(yīng)，加入酶標(biāo)儀中比色，分別計(jì)算2組血清MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP含量。2）Western Blotting檢測：取出凍存的大鼠腦、心、肺組織，解凍后去血去污，液氮冰上研磨至粉末狀。加入含苯甲基磺酰氟（PMSF）的裂解液400 μL，于勻漿器中勻漿，冰上孵育30 min后移入離心管，4 ℃離心15 000 r/min，20 min，取上清細(xì)胞裂解液用BCA法檢測蛋白濃度。蛋白樣品沸水加熱5 min充分變性蛋白。制好十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠后加入1×上樣緩沖液，蛋白樣品冷卻后加樣進(jìn)行電泳，電泳電壓100 V，時(shí)間為 90 min，結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，洗滌，5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h。TBST洗滌緩沖液洗膜3次，加入1∶1 000比例一抗搖床上緩慢4 ℃孵育過夜，TBST洗滌緩沖液洗膜3次；加入1∶1 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗搖床上緩慢4 ℃孵育過夜，再TBST洗滌緩沖液洗膜3次。ECL化學(xué)發(fā)光顯影液顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光，分析NF-κB蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，比較觀察組與對照組2組數(shù)據(jù)差別。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以（%）表示，采用χ 2檢驗(yàn)，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠腦、心、肺組織中NF-κB蛋白的表達(dá)" 觀察組大鼠腦、心、肺組織中NF-κB蛋白表達(dá)均明顯高于對照組（見圖1、圖2、圖3）；觀察組腦、心、肺組織NF-κB灰度值比較與蛋白表達(dá)相符，均高于對照組（均Plt;0.01）（見圖4，圖5、圖6）；腦、心、肺組織NF-κB蛋白相對表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.01）。見表1。本研究結(jié)果顯示，在慢性間歇低氧大鼠器官組織中，NF-κB蛋白均為高表達(dá)。

2.2 2組大鼠動(dòng)脈血清MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP水平比較 觀察組血清MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP水平均升高，與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），慢性間歇低氧大鼠多種炎癥介質(zhì)均升高。見表2。

3 討論

NF-κB是一種核蛋白，在基因轉(zhuǎn)錄中至關(guān)重要。同時(shí)，其生物學(xué)活性廣泛，主管著免疫和炎癥反應(yīng)，調(diào)控炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)外界因素刺激時(shí)，Inhibitor of NF-κB（IκB）磷酸化，原有的NF-κB/I-κB復(fù)合體解離，NF-κB游離出來并被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄，生成相應(yīng)的 mRNA［5］。

MCP-1蛋白由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞或細(xì)支氣管上皮細(xì)胞產(chǎn)生，作為單核細(xì)胞浸潤的主要因子，MCP-1與NF-κB關(guān)系密切，并受NF-κB調(diào)控。因此，慢性間歇低氧大鼠體內(nèi)NF-κB可能是MCP-1增加的主因［6］。糖尿病患者體內(nèi)可發(fā)現(xiàn)二者均有增高，而抑制了腎臟NF-κB活性后，NF-κB表達(dá)減少，MCP-1的產(chǎn)生及巨噬細(xì)胞浸潤也可隨之減少，腎臟炎癥狀態(tài)隨之緩解［7］。

慢性間歇低氧大鼠體內(nèi)的多種炎癥介質(zhì)包括TNF-α、IL-6、IL-8等均由NF-κB調(diào)控、轉(zhuǎn)錄。在生理狀況下，NF-κB并不表達(dá)或表達(dá)很少，它與其抑制因子Inhibitor of NF-κB（IκB）結(jié)合，為無活性狀態(tài)存在于胞漿中。疾病中任何的物理及化學(xué)因素刺激均可導(dǎo)致這種結(jié)合的分離，如病毒、細(xì)菌內(nèi)毒素、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及OSAHS的特征性改變——慢性間歇低氧。在這些變化刺激中，NF-κB與靶基因、增強(qiáng)子或早期炎癥反應(yīng)基因再結(jié)合，TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥介質(zhì)大量產(chǎn)生。TNF-α是機(jī)體免疫應(yīng)答的重要因子，過度的應(yīng)答聚集了大量中性粒細(xì)胞，繼續(xù)上調(diào)IL-8的表達(dá)，IL-8可進(jìn)一步趨化中性粒細(xì)胞，炎癥反應(yīng)更加嚴(yán)重［8］。

慢性間歇低氧大鼠的心肌細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)對心臟炎癥也起著至關(guān)重要作用［9］，并有可能參與了心臟疾病的發(fā)生發(fā)展［10］。IL-6是一種糖蛋白，多種淋巴細(xì)胞和非淋巴細(xì)胞均可產(chǎn)生，其可以調(diào)節(jié)CRP的合成，增加心臟心肌黏附分子的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)TNF-α釋放［11］。IL-6、CRP、TNF-α和NF-κB共同維持著心臟炎癥平衡，當(dāng)炎癥介質(zhì)IL-6、TNF-α增多時(shí)，會(huì)反饋?zhàn)饔糜贜F-κB，造成心肌惡性損害［12］。通過抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有可能阻斷炎癥損害惡性循環(huán)，減輕心肌損傷程度［13］。

慢性間歇低氧引起的損傷特征是缺血再灌注損傷。反復(fù)的缺氧，復(fù)灌注是心肌梗死、心力衰竭死亡的主要原因［14］。MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP共同參與了炎癥的發(fā)生發(fā)展過程，對心肌的缺血再灌注損傷起重要作用［15］。在缺血再灌注早期炎癥細(xì)胞即可侵入心肌細(xì)胞，并釋放這些炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)心肌損傷［16-17］。

本研究中，檢測到慢性間歇低氧大鼠腦、心、肺組織的NF-κB表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8、CRP不同程度激活，提示慢性間歇低氧是改變發(fā)生的根源。慢性間歇低氧可使機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)加強(qiáng)［18-19］，如果NF-κB被激活，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，IL-6、TNF-α等因子隨之增加，成為OSAHS患者的炎癥反應(yīng)基礎(chǔ)［20］。因此，找到適合OSAHS人群，應(yīng)用同時(shí)能阻斷NF-κB過度激活帶來的機(jī)體反應(yīng)的藥物，是我們治療OSAHS疾病的方向。

利益沖突聲明：無。

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