乳腺癌切片CD8+T細胞表達水平及腫瘤浸潤淋巴細胞與患者病理特征的關系

【摘要】目的 檢驗乳腺癌切片CD8⁺T細胞的表達水平，探討腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）與乳腺癌患者病理特征之間的關聯。方法 選取2020年10月至2022年10月隴南市第一人民醫院收治的84例乳腺癌確診患者為研究對象，所有患者均順利完成手術治療，且術后石蠟標本保存完好。采用免疫組化法檢測乳腺癌切片中CD8⁺T細胞表達情況，對切片進行伊紅染色（HE）法并檢測TIL水平，分析CD8⁺T細胞表達水平、TIL檢測結果與患者病理特征之間的關系。結果 TIL高水平、低水平患者的腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤大小、淋巴結轉移、人表皮生長因子受體2（HER-2）受體陽性等指標差異均無統計學意義（均Pgt;0.05），CD8⁺T陽性與CD8⁺T陰性患者的腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤大小差異有統計學意義（均Plt;0.05）。經Logistic回歸分析，CD8⁺T細胞表達水平與乳腺癌患者的腫瘤分化程度、TNM分期之間存在關聯（均Plt;0.05）。結論 TIL檢測結果與乳腺癌病理特征間無明顯相關性，但乳腺癌切片中CD8⁺T細胞表達情況與TNM分期、腫瘤分化程度有關，臨床應予以關注。

【關鍵詞】乳腺癌；CD8+T細胞；腫瘤浸潤淋巴細胞；病理特征

中圖分類號：R737.9 文獻標識碼：A 文章編號：2096-2665.2023.14.0.03

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2023.14.032

乳腺癌是威脅我國女性健康的主要惡性腫瘤之一，疾病負擔依然日益加重[1]。根據《中國腫瘤登記年報》數據，城市發病率變化趨勢平穩，農村發病率呈現上升趨勢[2]。針對乳腺癌的發病機制，既往研究多關注腫瘤細胞，主要側重圍繞基因及其表達蛋白的改變等問題進行分析。而在對乳腺癌患者腫瘤微環境進行評估時發現，局部免疫微環境改變可能與腫瘤發病、進展之間存在關聯[3]。任莉莉等[4]指出，乳腺癌患者體內腫瘤免疫微環境存在不同程度異質性，應用腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）進行過繼細胞治療是可能受異質性與免疫抑制等因素的影響。本研究對乳腺癌切片CD8+T細胞表達水平進行檢測，并就TIL與乳腺癌病理特征之間的關聯進行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年10月至2022年10月隴南市第一人民醫院收治的84例乳腺癌患者為研究對象。本研究經隴南市第一人民醫院醫學理論委員會批準。納入標準：①符合乳腺癌相關診斷標準[5]，經病理診斷證實；②順利完成手術治療（根治術/改良根治術）；③術后石蠟標本保存完好。排除標準：①確診時有轉移性腫瘤；②確診時患有其他腫瘤；③臨床資料不完整。

1.2 檢驗方法

1.2.1 伊紅染色法檢測與TIL判讀 伊紅染色（HE）法檢測步驟：①防脫片處理，取出乳腺癌標本（經固定、石蠟包埋），利用切片機（德國Leica，型號：LEICA RM2135）進行切片，厚度約4～6 μm；②進行粘片處理，確保切片展開，吸出多余水分，計數編號后備用；③常規脫蠟，置于蘇木素中染色1 min，磷酸緩沖液（PBS）定色，蒸餾水過洗后置入伊紅染液中約0.5 min，蒸餾水沖洗；④置入1%鹽酸乙醇液中褪色，再放入蒸餾水中漂洗，至恢復藍色；⑤置于50%、70%、80%梯度酒精中脫水，0.5%伊紅染液染色；⑥95%酒精洗去多余紅色，置于無水乙醇中3～5 min，濾紙吸去多余酒精，置于純二甲苯中3～5 min，中性樹膠封存。TIL判讀參考《腫瘤學年鑒雜志》標準[6]，根據顯微鏡視野中TIL占比將結果分為高水平（≥40%）與低水平（lt;40%）。

1.2.2 CD8+T細胞表達水平檢測 采用免疫組化法檢測，所用抗體、試劑盒均購自福州邁新生物技術開發有限公司，檢測步驟：①防脫片、切片、粘片等操作同上；②將載玻片置于65 ℃環境下烘烤約2 h，常規脫蠟；③選用EDTA（pH值=9.0）進行抗原修復，高壓修復2.5 min后，自然冷卻，直至恢復至室溫后滴加適量0.3% H2O2溶液，放置10 min；④每張玻片滴加1滴3% H2O2溶液，37 ℃孵育，15 min后用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，3 min/次，標記組織位置并滴入1滴10%羊血清，37 ℃孵育1 h；⑤以抗原稀釋液1：500稀釋后滴加抗體，每個玻片抗體量約60 μL，置入4 ℃冰箱放置一夜，取出后37 ℃復溫1 h；⑥DAB顯色（B-DAB與A-DAB底物緩沖液的混合比例為1∶20），蘇木素復染30～60 s，經分色、返藍后，用流水沖洗干凈；⑦經脫水、透明后封片，除去玻片表面多余的液體，并加入適量水溶性封片劑，45～55 ℃環境下烘干，直至凝固。免疫組化結果判定采用半定量積分法：①隨機選取10個200倍視野，統計1 000個TIL中CD8+細胞數，并按占比lt;5%、5%～25%、gt;25%～50%、gt;50%～75%、gt;75%分別計0～4分；②染色強度按淡黃色、黃色、棕黃色分別計1～3分；③細胞數計分×染色強度計分≤1為陰性，否則為陽性。

1.3 統計學分析 采用SPSS 25.0統計學軟件進行數據處理。計量資料用（x±s）表示，用t檢驗；計數資料用[例（%）]表示，用χ2檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 84例患者一般病理資料 本組患者一般病理資料見表1。

2.2 不同TIL結果患者臨床病理特征比較 對TIL高水平、低水平患者的腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤大小、淋巴結轉移、HER-2受體情況進行比較，結果發現差異無統計學意義（均Pgt;0.05），見表2。

2.3 CD8⁺T細胞表達水平與臨床病理關系 單因素分析發現，CD8⁺T陽性與CD8⁺T陰性患者的腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤大小差異均有統計學意義（均Plt;0.05），見表3。將3項指標作為自變量，按表4進行賦值，納入Logistic回歸模型中分析。結果發現，CD8⁺T細胞表達水平與乳腺癌患者的腫瘤分化程度、TNM分期之間存在關聯，差異均有統計學意義（均Plt;0.05），見表5。

3 討論

腫瘤細胞周圍的免疫微環境改變，是目前乳腺癌學術研究與臨床治療決策的重點。根據既往報道[7-8]，乳腺癌患者普遍存在TIL檢測結果異常，TIL計數的變化可能與多種乳腺癌類型患者的預后有關。從此類研究掌握的證據看，TIL計數水平在反映惡性腫瘤周圍免疫反應、控制惡性腫瘤發展等方面有重要作用。TIL包含多個淋巴細胞亞群，以T淋巴細胞為主要表型。CD8⁺T細胞是介導腫瘤編輯過程的重要角色，在接觸抗原后，可與腫瘤上對應受體發生相互作用，或間接誘導細胞凋亡，介導腫瘤的清除。本研究對TIL總體浸潤情況及CD8⁺T細胞表達水平與乳腺癌患者病理特征之間的關系進行分析，考慮不同分子分型T細胞表達水平的差異性可能影響結果的判斷，故主要選擇浸潤性乳腺癌患者。結果發現，TIL檢測結果與病理特征的相關性不強，而CD8⁺T細胞表達與TNM分期、腫瘤分化程度間呈現出較好相關性。

本研究中，按TIL檢測結果將患者分為高水平組與低水平組，比較兩組病理特征發現，TNM分期、腫瘤大小及分化程度等特征差異均無統計學意義（Pgt;0.05），提示TIL總體浸潤程度不能很好地反映腫瘤組織的特征。分析其原因，可能與TIL中各種淋巴細胞的作用不同有關。作為一類有特殊功能的細胞，TIL內有較廣泛的T細胞、NK細胞、B淋巴細胞等分布，各細胞之間可能存在正負效應，從整體進行浸潤程度評估，難以獲得各種細胞表達的變化，故其反映病理特征及預后的準確度可能較差。而本研究僅基于已有的石蠟標本以及單次檢測結果進行分析，且納入研究的樣本較少，總體TIL浸潤程度是否與病理特征存在關聯，后續仍需通過大樣本試驗做進一步驗證。同時，從預后評估角度考慮，將TIL濃度評估視作連續變量，納入乳腺癌患者預后評估體系，可能對今后乳腺癌的防治有良好的指導價值。

本研究選取CD8⁺T細胞表達情況進行分析，結果顯示，與陰性組相比，陽性組患者的腫瘤分化程度更傾向于高分化、中分化，TNM分期主要為Ⅰ～Ⅱ期，腫瘤≥2cm者占比較低。經Logistic分析，CD8⁺T細胞表達可能與腫瘤分化程度、TNM分期之間存在關系。分析其原因，可能與CD8⁺T淋巴細胞的毒性作用、宿主抑制腫瘤反應水平等有關。CD8⁺T淋巴細胞具有直接殺傷惡性腫瘤的能力，在免疫反應中，可特異性識別抗原肽組織，接到宿主殺死、清除惡性腫瘤，CD8⁺T細胞表達檢測呈陽性，可能提示局部免疫微環境的變化較小，T淋巴細胞能夠有效介導宿主清除腫瘤組織，避免病情的進一步惡化。除CD8⁺T細胞，TIL與乳腺癌患者病理特征的關聯，還應考慮其他細胞類型以及各類細胞之間的調控機制等，如CD4⁺T細胞具有的輔助作用，從免疫微環境改變角度考慮，圍繞不同免疫調節水平、免疫功能差異等在惡性腫瘤發展中的影響進行分析，明確T細胞表達、TIL浸潤程度與病理特征之間的關系，具有重要的現實意義。

綜上所述，總體TIL浸潤程度與乳腺癌患者的病理特征之間缺乏顯著相關性，考慮TIL內不同細胞的正負效應可能對TIL檢測結果的指導價值產生影響，而CD8⁺T細胞表達情況與TNM分期、腫瘤分化程度有關，可通過CD8⁺T細胞表達水平的動態檢測，評估乳腺癌患者的病情嚴重程度或預測腫瘤進展風險。

參考文獻

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