?高效降解廚余垃圾復合菌劑的構建及應用

摘 要：選取10種微生物菌株，分析其產淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶的能力，根據廚余垃圾中有機質成分及酶活功能信息構建一種高效降解廚余垃圾復合菌劑，并進行廚余垃圾堆肥的應用研究。結果表明：釀酒酵母產淀粉酶的能力最高，地衣芽孢桿菌產蛋白酶的能力最高，米曲霉產纖維素酶的能力最高，枯草芽孢桿菌產脂肪酶能力最高。拮抗性試驗發現只有短芽孢桿菌屬與地衣芽孢桿菌存在拮抗性關系。分別選取5株高酶活微生物構建4組復合菌劑，酶活測定結果表明，由鹽居固氮菌（Azotobacter salinestris）、綠色木霉（Trichoderma viride）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和米曲霉（Aspergillus oryzae）組配的F2微生物復合菌劑的產酶能力較好，其中淀粉酶為25.0 U/mL，蛋白酶為0.13 U/mL，纖維素酶為1 244 U/mL，脂肪酶為4.09 U/mL。堆肥結果表明：添加復合菌劑F2組最高溫達到67 ℃，高溫期持續14 d，C/N為18.31，pH值為9.08，種子發芽指數為103.17%，相較于CK組堆肥效果更好，可使堆肥高溫期延長4 d，堆肥提前6 d達到完全腐熟。

關鍵詞：廚余垃圾；微生物菌劑；篩選；堆肥

中圖分類號：S141.4 文獻標識碼：A 文章編號： 1006-060X（2023）03-0061-06

Abstract：According to organic matter components， and microbial enzyme activities and functions of kitchen waste， 10 microbial strains were selected and their abilities of producing amylase， protease， cellulase and lipase were analyzed so as to construct a compound microbial agent for kitchen waste efficient degradation. Then the constructed compound microbial agent was applied in the kitchen waste composting experiment. The results showed that the following strains had the strongest capacity to produce a specific enzyme： Saccharomyces cerevisiae for amylase， Bacillus licheniformis for protease， Aspergillus oryzae for cellulase， and Bacillus subtilis for lipase. Antagonistic test found that antagonistic relationship was only presented between Brevibacillus and Bacillus licheniformis. Eventually， five kinds of strains with high enzyme activity were selected to construct four groups of compound microbial agents. The results of enzyme activity test showed that the F2 compound microbial agent composed of Azotobacter salinestris， Trichoderma viride， Bacillus licheniformis， Bacillus cereus and Aspergillus oryzae had good enzyme production ability， of which the amylase activity was 25.0 U/mL， protease 0.13 U/mL， cellulase 1 244 U/mL and lipase 4.09 U/mL. Results of the composting experiment showed that in F2 group the maximum temperature reached 67 ℃， the high temperature period lasted for 14 days， the C/N was 18.31， the pH was 9.08， and the seed germination rate was 103.17%; compared with CK group， F2 group had better composting effect， in which the high temperature period was extended by 4 days， and the compost reached complete maturation 6 days in advance.

Key words：kitchen waste; microbial agent; select; compost

隨著經濟社會的發展，人們生活水平逐漸提高，我國廚余垃圾的產生量也在急劇增長。廚余垃圾主要成分為水、淀粉、蛋白質、油脂和纖維素，以及無機鹽等[1]，容易腐爛變質，對環境衛生造成惡劣影響[2]。因此，如何將廚余垃圾進行清潔處理并資源化利用受到越來越多研究者的關注。目前廚余垃圾資源化利用技術主要是厭氧消化、好氧堆肥、生物養殖以及化學煉制[3]，其中厭氧消化是最主要的處理方式，但是厭氧消化工程投資較大、產生的沼液需二次處理。而好氧堆肥因為工程投資較小、堆體腐熟后可以制成有機肥料[4]等優點而受到關注，但是傳統好氧堆肥仍存在處理周期較長、有機物降解率不高等問題[5]。因此，很多學者通過添加微生物菌劑來縮短發酵周期，提高腐殖化率[6-7]。

在好氧堆肥中常常以單一菌劑或復合菌劑的方式添加微生物[8-10]，其中復合菌劑一般具有種類全、配伍合理、功能性強等優點[11-15]，通過微生物的協同作用，堆肥降解率及腐熟效果遠遠大于單一菌劑。為了獲取高效降解菌株，學者通常采用定向篩選法，即以特定培養基通過降解圈篩選出降解菌。例如咸芳[16]通過測定有機質降解圈從餐廚垃圾中篩選出具有淀粉、蛋白質、纖維素及油脂降解效果的菌株復配成復合菌劑，并進行餐廚垃圾堆肥試驗，結果表明添加復合菌劑能快速分解餐廚垃圾，可以加快腐熟進程，實現餐廚垃圾的有效減量化；石娟[17]以大豆油為唯一碳源，通過測定生物量、脂肪酶活性和油脂降解率分離篩選出一株嗜熱嗜氣解硫胺素芽孢桿菌。然而這種篩選方法耗時長，且能夠通過培養方法篩選出來的微生物很少，而通過測定菌株培養發酵液的酶活能更直觀的體現菌株的功能信息，比較各菌株的酶活大小，篩選出優勢菌，耗時更短。因此，基于微生物產酶功能信息有針對性地挑選功能菌株將更加精準且高效[18-19]。

筆者選取10株微生物菌株，分析其產淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶的能力，從而得到各菌株的微生物產酶功能信息，并根據堆肥原料中有機質成分挑選出對應的高產酶菌株。基于微生物拮抗性試驗，根據廚余垃圾中有機質的比例，選擇5種產酶能力不同的微生物菌株構建4種復合微生物菌劑，測定其產酶能力，由鹽居固氮菌、綠色木霉、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和米曲霉組配的F2復合菌劑的產酶能力較好，選取F2組復合菌劑進行以廚余垃圾為原料，秸稈為調理劑的堆肥應用研究。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株與培養基

試驗菌株購自于中國工業微生物菌種保藏管理中心。采購的菌株包括4株細菌：a-枯草芽孢桿菌、b-蠟樣芽孢桿菌、c-短芽孢桿菌屬、d-地衣芽孢桿菌；1株霉菌：e-綠色木霉；2株酵母菌：f-釀酒酵母、g-米曲霉；1株放線菌：h-鏈霉菌屬；2株固氮菌：m-鹽居固氮菌、n-褐球固氮菌。具體培養條件見表1。

1.2 菌株活化與培養

吸取約0.5 mL相應的液體培養基于凍干管中，將凍干菌粉充分溶解。取0.2 mL菌懸液轉移至裝有5～8 mL相應的液體培養基的試管中混勻，并取0.1 mL菌懸液轉移至固體培養基上，進行劃線分離。活化后的菌種配置OD600=1的菌懸液按10%接種量接種于相應的液體培養基中。隨后置于各菌株相應的培養條件下培養，并進行傳代培養至第3代[20]。

1.3 菌株產酶能力測定

分別將第3代菌株接種至相應的培養基中，按照表1中的條件進行培養。取發酵液10 mL在4℃，8 000 r/min離心10 min，取上清液作為粗酶液，采用ZCI BIO試劑盒測定淀粉酶，蛋白酶，纖維素酶和脂肪酶的活性[21]，通過比較這10株菌的酶活大小，挑選出產酶能力強的菌株。

1.4 復合菌劑的構建

1.4.1 拮抗性試驗 取上述10株菌兩兩混合接種于PDA固體培養基，呈十字劃線，倒置在恒溫培養箱30℃培養48 h，觀察菌種的生長情況，確認是否出現拮抗現象[22]。

1.4.2 構建高效堆肥復合菌劑 根據廚余垃圾中有機質的比例，選擇5種產酶能力不同的菌株構建4組復合微生物菌劑[23]，培養48 h后測定復合菌劑產淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶的能力[24-28]。

1.5 復合菌劑堆肥應用研究

1.5.1 復合菌劑制備 分別制備鹽居固氮菌、米曲霉、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、綠色木霉的菌懸液（OD600=1），并按照1∶1∶2∶1∶1的體積配比制成100 mL復合菌懸液，并將其接種于1 L培養基內在35℃恒溫搖床內擴大培養96 h制成F2復合菌劑。

1.5.2 堆肥試驗方法 采用堆肥桶進行廚余垃圾好氧堆肥試驗，設置2個試驗組：空白組（CK），添加復合菌劑組（F2）。以廚余垃圾為原料，秸稈作為調理劑，二者按照鮮重4∶1的比例進行充分混合，調節堆體的含水率為68%，C/N為22.9。CK組和F2組分別在堆肥初期添加等量的超純水和1%復合菌劑發酵液，混合均勻后在堆肥桶中進行堆置38 d。每天上午10：00使用3個溫度計分別插入堆體的上、中、下層，待溫度計穩定后記錄溫度值；樣品采集方式為5點采樣法，采用分層的形式，在堆體中心取一點，堆體上層和下層各隨機取兩點，樣品混合均勻[29]。

1.5.3 測定方法 在堆肥0、1、3、5、8、11、15、19、25、31、38 d測定相關理化參數。理化參數的測定參考黃紅麗與戴美玲的測定方法[30-31]。含水率采用重量法測定；使用pH計測定堆肥濾液的pH值；總有機碳采用灼燒法測定；總氮采用凱氏定氮法測定；通過使用恒溫生化培養箱測定堆肥樣品濾液中種子發芽指數GI。GI（%）=（樣品種子發芽數×發芽根長）/（空白種子發芽數×發芽根長）×100。

1.6 數據統計與分析

采用Excel 2019進行數據統計分析，繪圖采用Origin 2018完成。

2 結果與分析

2.1 不同菌株的產酶能力研究

對購買的這10株微生物菌株進行活化傳代培養，并測定微生物產淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶的能力，其結果見表2。廚余垃圾中含有淀粉、蛋白質、纖維素和油脂等有機質，而微生物菌株是否產生淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶可以體現其是否具有降解這些有機質的能力，酶活大小則體現其降解相應有機質的能力差異。從表2可以看出，10株菌株都具有產淀粉酶的能力，其中釀酒酵母產淀粉酶的能力最高，酶活性為37.2 U/mL；除了短芽孢桿菌屬都具有產蛋白酶的能力，其中地衣芽孢桿菌產蛋白酶的能力最高，酶活性為0.151 U/mL；只有綠色木霉、米曲霉和枯草芽孢桿菌能產纖維素酶，其中米曲霉的酶活數值最高，酶活性為1353.1 U/mL；10株單菌中只有鏈霉菌屬、米曲霉、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和褐球固氮菌能產脂肪酶，其中枯草芽孢桿菌產脂肪酶能力最高，酶活性達到10.2 U/mL。

2.2 高效堆肥復合菌劑構建

拮抗試驗是為了探明2株菌共存時二者是否存在拮抗作用，是否影響微生物的生長及活性，從而影響復合菌劑對廚余垃圾堆肥腐熟的效果。拮抗性試驗結果如表3所示，短芽孢桿菌屬和地衣芽孢桿菌有拮抗性，此外其他各菌彼此不存在拮抗作用。

每株單菌培養相應時間后制備菌懸液（OD600= 1），根據廚余垃圾中淀粉、蛋白質、纖維素及油脂等有機質比例，分別調整添加具有相應產酶能力的微生物菌株液體體積的比例，以10%的接種量構建4組高效復合菌劑[32-33]，具體組配比例如表4所示。在35 ℃下在恒溫振蕩培養箱以150 r/min下振蕩培養48 h后分別測定這四組復合菌劑的產酶活性，其結果如表5所示。

從表5中酶活數值可以看出，F1組沒有產纖維素酶的能力；F2組的淀粉酶和纖維素酶活最高，酶活性分別為25 U/mL和1 244 U/mL，混合培養相比較單菌培養提高了產淀粉酶和蛋白酶的能力；F3組產脂肪酶的能力最好，酶活性為5.31 U/mL，混合培養提高了產蛋白酶的能力；F4組的蛋白酶酶活最高，酶活性為0.2 U/mL，比單菌培養時地衣芽孢桿菌產蛋白酶高0.05 U/mL，說明微生物菌株相互協同，共同作用，提高了產酶能力。基于實驗結果，挑選F2組復合菌劑進行以廚余垃圾原料，秸稈為調理劑的堆肥試驗。

2.3 高效堆肥復合菌劑應用研究

2.3.1 堆肥過程中堆體溫度的動態變化 溫度是反映堆肥是否正常進行的直接指標。堆肥過程中對照組和實驗組的溫度變化如圖1所示，堆肥在7—8月進行，環境溫度為32～38℃。堆肥過程中，主要經歷3個階段，即升溫階段、高溫階段和降溫腐熟階段。CK組于第5 天進入高溫期，高溫期持續10 d，最高溫度達到65℃；F2組于第4 天進入高溫期，高溫期持續14 d，最高溫度達到67℃。相較于CK組，F2組提前1 d進入高溫期，高溫期溫度更高，持續時間更長，說明廚余垃圾中原有的土著微生物活性不高，而添加自制復合菌劑F2能夠通過增加微生物活性分解有機物產生熱量使溫度上升，有利于殺滅蟲卵等有害物質，有效促進堆體腐熟。隨著堆肥反應的持續，底物中的易降解物質基本都被微生物分解，體系內的各種有機質的分解反應也越來越徹底，因此溫度會降低。

2.3.2 堆肥過程中堆體pH的動態變化 pH值是影響微生物生長活動的重要指標之一。堆肥期間pH值變化如圖2所示。CK、F2組pH值總體呈現出先上升后下降的趨勢，在堆肥初期，由于堆體中存在大量易分解的有機質，微生物活性較高，這些有機物被微生物迅速分解，產生了一些有機酸，但由于廚

余垃圾中氮元素含量較高，微生物將堆料中含氮有機物分解產生NH3，從而使堆體的pH值逐漸上升，25 d后pH值下降可能是由于堆料中含氮量較高的有機物基本被降解完，而后期主要是對調理劑秸稈的降解，秸稈以木質纖維素為主，氮素含量較低，因此pH值略有下降。在堆肥過程中，微生物不斷交互作用調節 pH 值，2組 pH 均處于堆肥微生物適宜生長范圍中，CK組與F2組的pH值變化相似，說明添加復合菌劑對堆體pH值的影響不大。

2.3.3 堆肥過程中堆體C/N的動態變化C/N 是高效堆肥的關鍵因素之一，影響著堆肥的效率和有機肥的品質。在堆肥過程中，原料中的碳含量和氮含量對堆肥微生物至關重要。堆肥過程中C/N的變化如圖3所示，堆肥初始物料C/N為22.90，總體均呈下降趨勢，易分解的含碳有機物被微生物分解吸收利用，并通過呼吸作用以CO2的形式排出，因而碳含量逐漸變低，氮素會被微生物利用以NH3的形式揮發，但是總氮的下降幅度低于總碳的下降幅度，導致總氮的相對含量增加，使碳氮質量比下降，直至堆肥結束，CK、F2組的C/N從22.90下降到18.90、18.31，均達到了腐熟標準，接種F2復合菌劑堆肥的C/N低于CK組，說明接種菌劑更有利于降解有機質。

2.3.4 堆肥過程中堆體GI的動態變化 種子發芽指數（GI）是堆肥腐熟度的重要指標，通常當GI達到80%以上標志著堆肥完全腐熟。堆肥期間不同處理組的種子發芽指數的變化如圖4所示，隨著堆肥反應的進行，種子發芽指數均呈逐漸升高的趨勢。堆肥初始2個試驗組的種子發芽指數均低于40%，表明堆體中含有許多不利于植物生長的毒性物質，如有機酸、多酚等，后期隨著堆肥反應的進行，溫度持續升高，有毒有害物質逐漸被分解，逐漸減弱對植物生長的抑制作用，種子發芽指數逐漸提升，隨著堆體溫度下降，堆體中不再有劇烈的生物活動，堆肥達到穩定的腐熟狀態，添加自制復合菌劑的F2組在第25 天達到完全腐熟，而CK組在第31 天才達到完全腐熟，直至反應結束，CK、F2組GI值分別為89.44%、103.17%。表明添加自制復合菌劑加快了底物的代謝，促進了堆體的腐熟。

3 討論與結論

添加菌劑是廣為使用的加快好氧堆肥腐殖化進程的一種方式，國內外學者對復合菌劑的研發開展了大量研究工作。大部分學者采用有機質降解圈或者產酶能力篩選出需要的菌株[15-18]，并測定菌株間的拮抗關系，最終構建復合菌劑。如張丹等[18]基于環境微生物資源庫，根據菌株產酶功能信息定向挑選出高產酶菌株，測定菌株間拮抗關系，針對易腐垃圾成分構建了一組復合菌劑。

筆者根據廚余垃圾有機物組成定向挑選了10株微生物菌株，通過測定菌株的產酶的能力，釀酒酵母產淀粉酶的能力最高，地衣芽孢桿菌產蛋白酶的能力最高，米曲霉產纖維素酶的能力最高，枯草芽孢桿菌產脂肪酶能力最高。并測定菌株間拮抗試驗發現短芽孢桿菌屬與地衣芽孢桿菌具有拮抗作用，其他無拮抗作用。從中挑選出高酶活微生物5株，根據廚余垃圾有機質比例調整添加微生物菌懸液體積比例，混合發酵組成4組復合菌劑，測定產酶能力后發現由鹽居固氮菌、綠色木霉、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、米曲霉組合的F2復合菌劑產酶能力較高。

微生物菌劑可以通過影響好氧堆肥過程中的基本理化參數及微生物群落結構的變化，進而影響堆肥腐殖化進程和堆肥產品品質[34-35]。胡亞東等[36]在餐廚垃圾好氧堆肥中對比了不添加菌劑和分別添加商品菌劑（WD）、課題組自制復合菌劑（TB）、WD+TB復合微生物菌劑的效果，發現添加菌劑的處理組升溫快，有機質降解速率加快，堆體提前達到腐熟，尤其是添加WD+TB復合微生物菌劑的處理組堆肥腐熟效果最好，表明添加菌劑可以有效提升餐廚垃圾好氧生物處理效果，顯著提高堆肥效率。為了驗證F2復合菌劑對好氧堆肥腐殖化進程的影響，筆者將此復合菌劑應用于廚余垃圾好氧堆肥中，研究結果表明添加復合菌劑F2組最高溫達到67℃，高溫期持續14 d，C/N為18.31，pH值為9.08，種子發芽指數為103.17%，相較于CK組堆肥效果更好，可使堆肥高溫期延長4 d，堆肥提前6 d達到完全腐熟，這與前者研究結果一致。

綜上所述，基于微生物產酶功能信息針對降解成分定向精準挑選功能菌株是一種快速高效的復合菌劑構建方法。此方法可以推廣至其他領域，如改良土壤菌劑的構建、污染物降解復合菌系的構建等。

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（責任編輯：高國賦）