基于生物信息學(xué)的肩袖撕裂與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的共病研究

摘要：目的" 探討肩袖撕裂（RCT）與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（PMOP）之間的關(guān)系，為肩袖撕裂及絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的共病研究提供新的思路。方法" 收集自2021年1月1日-2022年6月30日因肩袖撕裂住院的絕經(jīng)后女性患者的骨密度，并進(jìn)行分析。應(yīng)用生物信息學(xué)的方法，構(gòu)建PMOP與RCT共同靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，使用cytoscape軟件插件cytohubba按照Degree篩選篩選核心基因，并使用R語言進(jìn)行GO及KEGG富集分析。結(jié)果" 共入組受試者104例，骨量異常共67例，占64.42%，其中骨質(zhì)疏松癥為17例，占16.35%。60歲以上人群，骨質(zhì)疏松癥約占1/3。通過查詢數(shù)據(jù)庫共獲得絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥相關(guān)基因共967個，肩袖撕裂相關(guān)基因共281個，共同靶點152個。篩選獲取前20位核心靶點，包括：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、白介素6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、金屬基質(zhì)蛋白酶2（MMP2）等。GO生物學(xué)過程主要集中在腺體發(fā)育、細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)等，KEGG主要富集在癌癥中的蛋白聚糖、雌激素信號通道等。結(jié)論" 肩袖撕裂和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥共病在臨床常見，兩者具有一定的相關(guān)性。未來可以從炎癥、血管再生、氧化應(yīng)激和雌激素相關(guān)信號通道進(jìn)行研究。

關(guān)鍵詞：絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥；肩袖撕裂；共病；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3；白介素6；血管內(nèi)皮生長因子A；金屬基質(zhì)蛋白酶2

中圖分類號：R681" " nbsp; " " " " " " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2023.15.002

文章編號：1006-1959（2023）15-0006-06

Study on the Comorbidity of Rotator Cuff Tear and Postmenopausal Osteoporosis Basedon Bioinformatics

WANG Qing，QIAN Yin-hua，QIAN Ping-kang，XU Feng

（Department of Orthopedics，Kunshan Hospital of Chinese Medicine，Kunshan 215300，Jiangsu，China）

Abstract：Objective" To explore the relationship between rotator cuff tear （RCT） and postmenopausal osteoporosis （PMOP）， and to provide new ideas for the study of the comorbidity of rotator cuff tear and postmenopausal osteoporosis.Methods" Bone mineral density of postmenopausal women hospitalized with rotator cuff tears from January 1， 2021 to June 30， 2022 were collected and analyzed. Using the method of bioinformatics， the PPI network of common target genes of PMOP and RCT was constructed. The core genes were screened according to degree by using cytoscape software cytohubba， and the enrichment analysis of GO and KEGG was carried out by using R language.Results" A total of 104 subjects were enrolled， of which 67 cases were abnormal bone mass， accounting for 64.42%， including 17 cases of osteoporosis， accounting for 16.35%. Osteoporosis accounts for about 1/3 of people over 60 years old. A total of 967 genes related to postmenopausal osteoporosis， 281 genes related to rotator cuff tear and 152 common targets were obtained by querying the database. The top 20 core targets were screened， including signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3）， interleukin 6 （IL-6）， vascular endothelial growth factor A （VEGFA）， matrix metalloproteinase 2 （MMP2）， etc. GO biological processes mainly focus on gland development， cellular response to oxidative stress， etc. KEGG was mainly enriched in proteoglycans in cancer， estrogen signaling pathway， etc.Conclusion" Rotator cuff tear and postmenopausal osteoporosis are common in clinic， and there is a certain correlation between them. In the future， we can study the signal channels related to inflammation， angiogenesis， oxidative stress and estrogen.

Key words：Postmenopausal osteoporosis;Rotator cuff tear;Comorbidity;Signal transducer and activator of transcription 3;Interleukin 6;Vascular endothelial growth factor A;Metalloproteinase 2

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是絕經(jīng)后女性常見的骨骼疾病，其特點是骨量下降，骨骼微結(jié)構(gòu)損傷，容易發(fā)生腰椎、髖部等脆性骨折，造成社會及家庭嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[1]。肩袖撕裂（rotator cuff tear，RCT）是中老年人群肩關(guān)節(jié)疼痛的常見原因，診治不當(dāng)容易導(dǎo)致肩關(guān)節(jié)功能障礙甚至殘疾。在絕經(jīng)后女性人群中，RCT合并骨質(zhì)疏松非常常見，兩者有一些共同的危險因素，如：年齡、吸煙、高膽固醇血癥、遺傳等[1-3]，提示RCT與PMOP可能存在一些內(nèi)在關(guān)聯(lián)。本研究分析了2021年1月1日-2022年6月30日因RCT住院的絕經(jīng)后女性患者的骨密度情況，并應(yīng)用生物信息學(xué)方法對PMOP及RCT的共病基因進(jìn)行分析，篩選出兩者共同的靶點及涉及的信號通道，為RCT合并PMOP的臨床治療提供新的思路。

1資料與方法

1.1一般資料" 收集昆山市中醫(yī)醫(yī)院自2021年1月1日-2022年6月30日因RCT住院的絕經(jīng)后女性患者的骨密度，并進(jìn)行分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：①絕經(jīng)后女性，自然絕經(jīng)＞1年；②診斷為RCT；③患者無可能影響骨代謝的慢性疾病；④患者6個月內(nèi)未服用影響骨密度的藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重的內(nèi)科基礎(chǔ)疾病及精神疾病；②合并惡性腫瘤。骨密度由技術(shù)員使用雙能X射線吸收儀（美國通用電氣醫(yī)療公司，型號Lunar）進(jìn)行測量。骨密度結(jié)果通常以T值表示，T值=（實測值-同種族同性別正常青年人峰值骨密度）/同種族同性別正常青年人峰值骨密度的標(biāo)準(zhǔn)差。T值≤-2.5診斷為骨質(zhì)疏松癥，T值≥-1為骨量正常，-2.5＜T值＜-1.0為骨量下降。

1.2方法" 分別以絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis）及肩袖撕裂（rotator cuff tear）作為關(guān)鍵詞，在疾病數(shù)據(jù)庫（Disgenet、TTD、Genecards）中篩選靶點，其中Genecards 篩選相關(guān)度≥1。使用Venny2.1.0得到兩種疾病的共同靶點，通過string數(shù)據(jù)庫制作靶點間相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)，并導(dǎo)入cytoscape3.7.2，使用插件cytohubba按照節(jié)點連接度（degree）篩選核心靶點。使用R語言進(jìn)行GO生物過程富集分析以及KEGG通路富集分析，分別將篩選出的前10個GO條目與前15條KEGG條目進(jìn)行可視化。

2結(jié)果

2.1 RCT絕經(jīng)后女性的骨密度情況" 共入組受試者104例，骨量異常共67例，占64.42%，其中骨質(zhì)疏松癥為17例，占16.35%，骨量下降為50例，占48.08%。骨量正常者為37例，占35.58%。40～49歲組共18例，其中骨量正常為11例，骨量下降為7例；50～59歲組共36例，其中骨量正常為14例，骨量下降為18例，骨質(zhì)疏松4例；60～69歲組共37例，其中骨量正常為9例，骨量下降為17例，骨質(zhì)疏松11例；＞70歲組共12例，其中骨量正常為1例，骨量下降為7例，骨質(zhì)疏松4例。

2.2 PMOP及RCT相關(guān)基因收集結(jié)果" 通過疾病數(shù)據(jù)庫查詢，共獲得絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥相關(guān)基因共967個，肩袖撕裂相關(guān)基因共281個，生成韋恩圖，映射出共同靶點152個（圖1）。

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點基因" 經(jīng)string數(shù)據(jù)庫在0.9信度下構(gòu)建PMOP與RCT相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2），網(wǎng)絡(luò)共有151個節(jié)點，具有581條相互作用關(guān)系。

導(dǎo)入cytoscape軟件并進(jìn)行分析，使用插件cytohubba按照Degree篩選，獲取前20位核心靶點，包括：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、白介素6（IL-6）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、表皮生仔因子受體（EGFR）、金屬基質(zhì)蛋白酶2 （MMP2）等（圖3）。

2.3 GO及KEGG富集分析" 使用R語言clusterProfiler包進(jìn)行GO及KEGG富集分析。GO生物學(xué)過程主要集中在腺體發(fā)育（gland development），細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)（cellular response to oxidative stress）、細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)急的反應(yīng)（cellular response to chemical stress）、細(xì)胞對活性氧的反應(yīng)（cellular response to reactive oxygen species）等；KEGG主要富集在癌癥中的蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer）、松弛素信號通道（relaxin signaling pathway）、雌激素信號通道（estrogen signaling pathway）、內(nèi)分泌抵抗信號通道（endocrine resistance）等。選取前10條GO及15條KEGG結(jié)果以氣泡圖的形式展示（圖4、圖5）。使用cytoscape軟件件繪制 PMOP與RCT共同靶基因-信號通路相互作用圖（圖6）。使用R語言繪制雌激素信號通道（圖7），框內(nèi)為PMOP與RCT共病基因。

3討論

RCT與PMOP均是年齡相關(guān)性疾病。骨質(zhì)疏松增加了肩袖修補(bǔ)術(shù)的手術(shù)難度，并與術(shù)后再撕裂有關(guān)。因此研究RCT與PMOP相關(guān)性具有重要的臨床價值。本研究回顧性的分析了RCT絕經(jīng)后女性患者的骨密度情況，結(jié)果表明骨量異常占64.42%，其中骨質(zhì)疏松癥占16.35%。60歲以上人群，骨質(zhì)疏松癥約占1/3，這說明RCT和PMOP共病非常常見，兩者具有一定的相關(guān)性。

本研究通過構(gòu)建PMOP與RCT共同靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選出STAT3、IL-6、MAPK3、VEGFA、EGFR、MMP2等關(guān)鍵蛋白。STAT3參與骨代謝調(diào)節(jié)，與多種骨骼疾病有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)STAT3通過線粒體途徑調(diào)控成骨細(xì)胞，通過組織蛋白酶K（cathepsin K）調(diào)控破骨細(xì)胞，敲除STAT3的成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞均出現(xiàn)功能障礙，進(jìn)而引起骨骼疾病[4，5]。STAT3在撕裂的肩袖組織中高表達(dá)，并與腱內(nèi)血管系統(tǒng)有關(guān)[6]。絕經(jīng)后女性的雌激素水平下降，使免疫系統(tǒng)低度活化，促炎因子IL-6、TNF-α等能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，MCSF）和核因子κ B受體活化因子配體（Receptor Activator for Nuclear Factor-κ B Ligand，RANKL）的表達(dá)，刺激破骨細(xì)胞并抑制成骨細(xì)胞，造成骨代謝失衡。炎癥與RCT關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)[7]，炎癥性疾病中RCT的發(fā)生率升高。IL-6、IL-1等促炎因子能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡是RCT最要的病理學(xué)表現(xiàn)[8]，RCT邊緣細(xì)胞凋亡數(shù)量是正常的2倍[9]。VEGF能夠調(diào)控骨髓充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞，并且促進(jìn)血管生成，參與偶聯(lián)血管與骨的生成與重建，在骨代謝中發(fā)揮重要作用[10]。研究發(fā)現(xiàn)[11]，PMOP患者的VEGF水平明顯低于正常人群，說明VEGF與骨質(zhì)疏松癥具有重要關(guān)聯(lián)。血管生成與RCT同樣密不可分。RCT常發(fā)生在距離肩袖止點1 cm的乏血管區(qū)。RCT患者的肩峰下滑囊中，高表達(dá)VEGF[12]。肩袖腱病患者的血清VEGF也顯著升高[13]。另外，VEGF對肩袖腱骨愈合也至關(guān)重要[14]。

GO生物學(xué)過程主要集中在氧化應(yīng)激相關(guān)的多條途徑。氧化應(yīng)激對骨重建有重要的影響：①刺激破骨細(xì)胞分化。ROS通過RANK-RANKL-OPG、ERK-NF-κB等多條信號通道促進(jìn)破骨細(xì)胞分化[15]；②降低骨祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞譜系分化。氧化應(yīng)激導(dǎo)致骨祖細(xì)胞，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化減弱[16]；③降低成骨細(xì)胞活性，增加成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激導(dǎo)致ROS積聚，造成線粒體功能障礙，影響細(xì)胞分化，并最終誘導(dǎo)成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞凋亡[17]。同時，氧化應(yīng)激與肌腱退變有關(guān)。氧化應(yīng)激導(dǎo)致肌腱膠原合成減少，基質(zhì)降解增多[8]。既往研究提示，氧化應(yīng)激與肩袖退變、撕裂及術(shù)后腱骨愈合不良有關(guān)。Yazar I等[18]的一項研究發(fā)現(xiàn)，退行性肩袖撕裂患者的血清氧化應(yīng)激指標(biāo)遠(yuǎn)高于對照組，暗示氧化應(yīng)激可能與退行性RCT有關(guān)。Itoigawa Y等[19]的一項研究發(fā)現(xiàn)，肩袖術(shù)后再撕裂患者的超氧化物歧化酶遠(yuǎn)高于肩袖愈合患者，提示超氧化物誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可能是肩袖術(shù)后再撕裂的重要原因。有動物研究也得到類似的結(jié)果[20]。

KEGG信號通道富集在癌癥中的蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、松弛素（Relaxin signaling pathway）、雌激素（estrogen signaling pathway）等信號通道。其中，雌激素信號通道在PMOP及RCT中均具有重要的作用。PMOP主要是由于絕經(jīng)后雌激素水平下降，雌激素對破骨細(xì)胞的抑制作用減弱，破骨細(xì)胞數(shù)量增多，骨吸收能增強(qiáng)。另一方面，雌激素作為抗氧化劑的能力減弱，氧化應(yīng)激導(dǎo)致成骨前體細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞凋亡增多，骨形成能力下降，最終造成骨代謝失衡。雌激素對肌腱的代謝和功能具有重要影響[21]。Longo UG等[22]的一項研究發(fā)現(xiàn)，岡上肌腱細(xì)胞表達(dá)雌激素受體，且絕經(jīng)后女性撕裂的岡上肌肌腱細(xì)胞的雌激素受體表達(dá)量遠(yuǎn)高于男性，并與組織病理學(xué)評分有相關(guān)性。體外實驗發(fā)現(xiàn)[23]，雌激素能刺激岡上肌肌腱來源的細(xì)胞增殖。全層肩袖撕裂與雌激素相關(guān)受體-β（ESRRB）顯著相關(guān)[24]，并且雌激素水平還與肩袖術(shù)后再撕裂有關(guān)[25，26]。

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)的方法，初步探討了PMOP與RCT之間的共病基因及相關(guān)信號通道，為探索PMOP與OP的治療靶點提供了一定理論參考。根據(jù)生物信息學(xué)分析的結(jié)果，對于絕經(jīng)后女性，RCT合并骨質(zhì)疏松的治療，未來可以從以下幾個方向探索：①炎癥與免疫調(diào)節(jié)；②血管再生；③抗氧化應(yīng)激；④雌激素及相關(guān)受體調(diào)節(jié)。本研究仍存在一定的局限性，臨床部分納入的樣本數(shù)較少，生物信息學(xué)分析僅停留在信息整合及理論分析階段，未來仍需根據(jù)生物信息學(xué)的結(jié)果，開展進(jìn)一步的臨床及到動物研究，闡明PMOP與RCT之間關(guān)系，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

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收稿日期：2022-10-29；修回日期：2022-11-25

編輯/肖婷婷

基金項目：蘇州市臨床重點病種診療技術(shù)專項項目（編號：LCZX202127）

作者簡介：汪青（1983.5-），男，江蘇昆山人，博士，副主任醫(yī)師，主要從事骨質(zhì)疏松骨病與運動損傷的研究

通訊作者：徐鋒（1970.12-），男，江蘇昆山人，本科，主任醫(yī)師，主要從事骨關(guān)節(jié)病與運動損傷的研究