長鏈非編碼TINCR介導乳腺癌化療耐藥的生物信息學分析

摘要：目的" 探討長鏈非編碼RNA-TINCR在耐藥性乳腺癌中的表達、生物學功能、相關信號通路及其與患者預后的關系。方法" 利用GEPIA在線數據庫比較人乳腺癌組織和正常組織中TINCR基因的mRNA的相對表達水平，通過qPCR方法驗證敏感、耐藥乳腺癌細胞中TINCR的表達量，借助Kaplan-Meier ploter在線數據庫分析TINCR表達量高低與乳腺癌患者生存預后的關系。采用CCK8法檢測改變TINCR表達量對腫瘤細胞化療敏感性的改變，Metascape在線數據庫預測TINCR的相互作用蛋白，借助DAVID對相關基因功能進行GO和KEGG 信號通路功能富集分析。最后初步探討耐藥細胞中異常表達的TINCR是如何產生的。結果" TINCR在乳腺癌組織及耐藥乳腺癌細胞中高表達，升高TINCR表達水平可促進乳腺癌細胞對化療藥物的耐藥，分析出TINCR相互作用蛋白有150個，這些蛋白調控蛋白質翻譯、mRNA和rRNA的加工、mRNA的出核轉運、核糖體小亞基的形成等生物學過程，信號通路富集結果主要分布在核糖體、冠狀病毒疾病、剪切體、核質運輸、mRNA監測通路等方面。TINCR啟動子區具有ERα結合，且使用ERα抑制劑可顯著抑制TINCR表達量。結論" TINCR在耐藥乳腺癌細胞中呈高表達水平，與患者的預后不良有關，對乳腺癌化療耐藥的預測具有重要意義。

關鍵詞：TINCR；乳腺癌；化療耐藥；生物信息學

中圖分類號：R737.9" " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2023.15.001

文章編號：1006-1959（2023）15-0001-06

Bioinformatics Analysis of Long Non-coding TINCR-mediated Chemotherapy Resistancein Breast Cancer

DONG Chun-tao，WANG Si-qi，FEI Hao-ran，SI Xin-xin，SHI Xiao

（School of Pharmacy，Jiangsu Ocean University/Jiangsu Key Laboratory of Marine Pharmaceutical Compound Screening，Lianyungang 222005，Jiangsu，China）

Abstract：Objective" To investigate the expression， biological function， signaling pathways and prognosis of long non-coding RNA-TINCR in drug-resistant breast cancer.Methods" The GEPIA online database was used to compare the relative expression level of TINCR mRNA in human breast cancer tissues and normal tissues. The expression levels of TINCR in sensitive and resistant breast cancer cells were verified by qPCR method. Kaplan-Meier ploter online database was used to analyze the relationship between TINCR expression level and survival prognosis of breast cancer patients. CCK8 assay was used to detect the change of TINCR expression level on the sensitivity of tumor cells to chemotherapy. The Metascape online database was further used to predict the interacting proteins of TINCR， and the function enrichment analysis of GO and KEGG signaling pathways was conducted with the help of DAVID. Finally， we preliminarily explored how the abnormal expression of TINCR in drug-resistant cells was generated.Results" TINCR was highly expressed in breast cancer tissues and drug-resistant breast cancer cells. Elevated TINCR expression level could promote the resistance of breast cancer cells to chemotherapeutic drugs; a total of 150 TINCR-interacting proteins were finally screened. These proteins regulated biological processes such as protein translation， mRNA and rRNA processing， mRNA nuclear export transport， and ribosomal small subunit formation. The results of signal pathway enrichment were mainly distributed in ribosomes， coronavirus diseases， spliceosomes， nucleoplasmic transport， mRNA monitoring pathways， etc. The TINCR promoter region had ERα binding， and the use of ERα inhibitors could significantly inhibit TINCR expression.Conclusion" TINCR is highly expressed in drug-resistant breast cancer cells， which is related to the poor prognosis of patients， and is of great significance for the prediction of chemotherapy resistance in breast cancer.

Key words：TINCR;Breast cancer;Chemotherapy resistance;Bioinformatics

乳腺癌（breast cancer）是一種高度異質性的腫瘤，是我國女性最常見的惡性腫瘤之一[1]，其在組織形態、免疫表型、生物學行為及治療反應上存在著極大的差異，其發病率和死亡率呈逐年上升趨勢[2]。化療作為乳腺癌的重要治療手段之一，雖已取得了不錯的療效，但隨之而來的藥物耐受成為了限制化療療效的主要瓶頸。研究發現[3]，雌激素受體（ER）陽性的乳腺癌患者對一線化療藥物更易產生耐藥性，潛在的機制仍有待進一步闡明。近年來長鏈非編碼RNA（lncRNA）在腫瘤耐藥中的作用受到廣泛關注。組織分化誘導的非蛋白質編碼RNA（tissue differentiation-inducing non-protein coding RNA，TINCR）是位于人類19p13.3染色體上的lncRNA，在多種腫瘤中表達顯著升高，并通過靶向癌癥相關信號通路中的關鍵分子影響腫瘤的發生、發展[4]。如在口腔鱗癌中，過表達TINCR可通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進細胞增殖和轉移[5]；在胃癌中，TINCR可通過靶向Krupple Like Factor 2（KLF4）基因抑制細胞凋亡[6]。相關研究顯示[7]，TINCR通過調節miR-125b及其靶基因ERBB2的表達在刺激腫瘤發生中的作用，并且它與miR-125b的相互作用已被證明可以釋放HER-2并促使曲妥珠單抗耐藥。有研究發現三陰性乳腺癌患者血清中的TINCR增高，與腫瘤增殖、侵襲和遷移有關，具有潛在的預測價值[8]，但TINCR在乳腺癌化療耐藥中的作用及其異常表達機制尚不清楚。因此，本研究借助GEPIA在線數據庫、Kaplan-Meier ploter在線數據庫、Metascape在線數據庫，通過qPCR和CCK8實驗，分析了長鏈非編碼RNA-TINCR在耐藥性乳腺癌中的表達、生物學功能、相關信號通路及其與患者預后的關系，并進一步探討了TINCR在腫瘤化療耐藥中的作用，旨在為臨床研發逆轉耐藥的分子靶向治療提供新的潛在靶點，為改進乳腺癌化療策略提供新的思路。

1資料與方法

1.1 TINCR基因表達分析" 使用GEPIA在線數據庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/）分析TINCR在癌和癌旁的表達水平。進入網站后，選擇Expression DIY模塊后，輸入基因名字，選擇癌癥種類為“BRCA”（乳腺癌），點擊plot后等待結果生成。

1.2生存分析" 使用Kaplan-Meier生存曲線分析網站（http：//kmplot.com/analysis/）分析TINCR在乳腺癌患者中的生存關系。選擇“Auto select best cutoff”和生存分析的類型后，點擊draw Kaplan-Meier ploter，保存生成的結果。

1.3 TINCR相互作用蛋白預測" 借助catRAPID（http：//service.tartaglialab.com/page/catrapid_group）進行預測，選擇“catRAPID omics v2.0”模塊，繼續選擇“transcripts VS RNA-binding proteome”。選擇所要分析的RNA類型為“long non-coding RNAs”，種屬為“Homo sapiens”，輸入RNA的序列，點擊提交并保存結果。

1.4基因本體（GO）分析和基因組京都百科全書（KEGG）富集分析" 利用DAVID數據庫對篩選得到的相互作用蛋白進行GO分析進行富集，包括了基因的細胞成分（cellular component，CC）、生物學過程（biological process，BP）和分子功能（molecular function，MF）層面的內容。此外進行KEGG分析，其包含了基因組學、系統功能組學和生物化學的信息，是系統分析基因組信息和基因功能的數據庫，有利于把基因及其表達信息整合起來進行研究。校正P＜0.01為差異有統計學意義。

1.5細胞培養" MCF-7和MCF-7/ADR細胞維持在含有1%青霉素/鏈霉素和10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養基中，并在37 ℃" 5%CO2的培養箱中培養。根據細胞生長的情況和實驗要求，隔1～2 d換1次完全培養液。待細胞滿培養皿底面80%～90%時，進行傳代。

1.6定量PCR" 根據Trizol試劑（RNA isolater Total RNA Extraction Reagent，諾唯贊）操作說明書提取細胞總RNA，使用逆轉錄試劑盒[HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper），諾唯贊]將RNA逆轉錄成cDNA。根據定量擴增試劑盒（AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，諾唯贊）說明書要求，加入擴增溶液，將實時熒光定量PCR儀開啟預熱10 min。上機前設置反應條件為：在95 ℃" 預變性15 min，在95 ℃" 變性10 s，在60 ℃" 退火20 s，在72 ℃" 延伸30 s，40個循環。

1.7細胞活力檢測" 將處理好的細胞接種于96孔板中，密度為 5×103個/孔。第2天，加入不同濃度的阿霉素處理細胞，48 h后在每個孔中加入10 μl CCK8溶液孵育2 h。最后，在酶標儀上450 nm波長下測定吸光度。

2結果

2.1 LncRNA TINCR在化療耐藥乳腺癌細胞中高表達" GEPIA在線數據庫顯示，TINCR在乳腺癌組織中的表達水平明顯高于正常組織，差有統計學意義（圖1A）。qRT-PCR結果顯示，與敏感細胞相比，TINCR的表達水平在乳腺癌耐阿霉素細胞株中顯著升高（圖1B）。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，TINCR的表達水平與乳腺癌患者的預后呈負相關，TINCR表達水平高的患者RFS顯著縮短（圖1C）。

2.2 TINCR對乳腺癌細胞化療耐藥的影響" 在TINCR高表達的耐藥細胞中轉染TINCR干擾片段（圖2A），TINCR被有效干擾。MTT結果顯示，干擾TINCR可顯著降低阿霉素藥物處理下細胞存活率，即可抑制乳腺癌細胞對阿霉素的耐受性（圖2B）。在TINCR 低表達的敏感細胞中轉染TINCR 過表達質粒，用不同濃度的阿霉素處理細胞，結果顯示，過表達TINCR細胞的存活率顯著高于對照組，即升高TINCR表達水平可促進乳腺癌細胞對阿霉素的耐藥性（圖2C、圖2D）。

2.3 TINCR可能參與腫瘤發生發展的相關通路" 通過catRAPID對TINCR在細胞內的相互作用蛋白進行了預測分析，得到150個候選蛋白，并進一步對這些靶基因進行生物學功能注釋和信號通路分析（圖3）。生物學過程主要富集于蛋白質翻譯、mRNA和rRNA的加工、mRNA的出核轉運、核糖體小亞基的形成等過程。細胞組分主要富集于核質、胞漿、核仁、核糖體、線粒體內膜等。分子功能主要富集于蛋白質結合、RNA結合、核糖體的結構組成等。信號通路主要富集于核糖體、冠狀病毒疾病、剪切體、核質運輸、mRNA監測通路等。

2.4 ERα參與耐藥細胞中TINCR的高表達" 通過在線ChIPseq數據分析發現TINCR基因的啟動子區存在大量ERα結合（圖4）。ERα可通過結合在特定DNA序列上發揮轉錄調控功能，并且ERα與乳腺癌化療耐藥密切相關。MCF-7耐藥細胞中給予ERα抑制劑處理，可顯著抑制TINCR的轉錄水平至處理前一半。

3討論

組織分化誘導的非蛋白質編碼RNA-TINCR是由分化良好的人體組織中分離出來的，為正常表皮分化所必需。近年來相關研究顯示，TINCR的異常表達與多種人類癌癥發生及耐藥有關，但其在乳腺癌化療耐藥中的作用卻不清楚。本研究借助實驗及生物信息學分析發現，TINCR在乳腺癌組織及耐藥乳腺癌細胞中高表達，TINCR可促進乳腺癌細胞對化療藥物的耐藥，其表達水平與乳腺癌患者的不良預后密切相關。

本研究進一步借助生物信息學工具對TINCR在細胞內的相互作用蛋白進行了預測分析，得到150個與TINCR相互作用蛋白，通過GO功能注釋和KEGG信號通路富集發現，這些蛋白調控蛋白質翻譯、mRNA和rRNA的加工、mRNA的出核轉運、核糖體小亞基的形成等生物學過程，信號通路富集結果主要分布在核糖體、冠狀病毒疾病、剪切體、核質運輸、mRNA監測通路等方面。候選基因中RPS19BP1、線粒體核糖體蛋白（MRPL41、MRPL42）、HADH和NPM1等基因在腫瘤發生發展過程中發揮重要作用，可能與乳腺癌耐藥發生有關。RPS19BP1通過對p53、HSF1、FOXO3a、STAT3和mTOR等多種蛋白的去乙?；富钚园l揮腫瘤促進或抑制的雙重作用。有研究顯示[9]，在接受化療后1年內未復發的乳腺癌患者中RPS19BP1基因表達水平相較于復發的患者明顯偏低，可作為治療乳腺癌耐藥的重要靶點。已有研究表明[10]，RPS19BP1基因在非肝硬化性肝細胞癌中過度表達與腫瘤分期、血管浸潤和腫瘤大小有關，可作為重要的生物標志物用于肝細胞癌的預后研究。MRPL41和是核編碼線粒體基因，負責編碼線粒體核糖體蛋白，可通過誘導細胞凋亡，在人類疾病中具有潛在的作用，但對其分子機制知之甚少。MRPL41可以通過穩定P53來抑制癌細胞的異種移植腫瘤生長，并阻斷細胞周期來抑制腫瘤細胞的增殖[11]。MRPL42在肺癌組織中過表達，與肺癌患者的腫瘤大小和淋巴結轉移密切相關[12]。因此，MRPL41和MRPL42可能作為癌癥預后的重要指標，以及成為逆轉乳腺癌耐藥的重要靶點。HADH基因由10個外顯子組成，負責編碼短鏈-L-3-羥基?；o酶A脫氫酶，催化線粒體中脂肪酸β氧化。在胃癌中，HADH表達水平降低的與晚期患者有關，HADH的缺失導致激活Akt信號通路，從而促進惡性腫瘤的發展[13]。另有研究證明[14]，HADH表達下降與腎透明細胞癌預后不良和免疫浸潤有關。因此，HADH可能作為潛在的治療靶點用于預后較差癌癥的治療。核磷素（NPM1）是一種核細胞質穿梭蛋白，可執行核糖體生物發生，染色質重塑，基因組穩定性，細胞周期進程和細胞凋亡等功能，其過表達，突變，易位或功能喪失而改變的調節可導致癌癥和腫瘤發生[15]。NPM1可以上調PD-L1的轉錄并抑制三陰性乳腺癌中的T細胞活性，與腫瘤的發生發展與耐藥密切相關[16]。故而，RPS19BP1、MRPL41、MRPL42、HADH和NPM1這5個關鍵基因，可能作為重要生物標志物用于乳腺癌耐藥的早期診斷，并為治療乳腺癌耐藥提供了重要靶點。

此外，本研究還初步分析了耐藥乳腺癌細胞中異常表達的TINCR是如何形成的，通過生物信息學分析發現TINCR啟動子區具有雌激素受體ERα結合位點，ERα在乳腺癌的發生、發展及耐藥中起關鍵作用[17]，ERα抑制劑可下調TINCR的結果提示了ERα可參與調控TINCR的表達，但還需進一步的實驗來探討ERα是如何調控TINCR。

綜上所述，TINCR在耐藥乳腺癌細胞中呈高表達水平，與患者的預后不良有關，對乳腺癌化療耐藥的預測具有重要意義。

參考文獻：

[1]Maughan KL，Lutterbie MA，Ham PS.Treatment of breast cancer [J].Am Fam Physician，2010，81（11）：1339-1346.

[2]Fahad Ullah M.Breast Cancer： Current Perspectives on the Disease Status[J].Adv Exp Med Biol，2019，1152：51-64.

[3]Finnegan RM，Elshazly AM，Schoenlein PV，et al.Therapeutic Potential for Targeting Autophagy in ER+ Breast Cancer [J].Cancers （Basel），2022，14（17）：4289.

[4]Lu D，Di S，Zhuo S，et al.The long noncoding RNA TINCR promotes breast cancer cell proliferation and migration by regulating OAS1 [J].Cell Death Discov，2021，7（1）：41.

[5]Ghafouri-Fard S，Dashti S，Taheri M，et al.TINCR： An lncRNA with dual functions in the carcinogenesis process[J].Noncoding RNA Res，2020，5（3）：109-115.

[6]Chen Z，Gao Y，Gao S，et al.MiR-135b-5p promotes viability， proliferation， migration and invasion of gastric cancer cells by targeting Krüppel-like factor 4 （KLF4） [J].Arch Med Sci，2020，16（1）：167-176.

[7]Xu S，Kong D，Chen Q，et al.Oncogenic long noncoding RNA landscape in breast cancer [J].Mol Cancer，2017，16（1）：129.

[8]Wang X，Li S，Xiao H，et al.Serum lncRNA TINCR Serve as a Novel Biomarker for Predicting the Prognosis in Triple-Negative Breast Cancer [J].Technol Cancer Res Treat，2020，19：1533033820965574.

[9]Bertozzi S，Londero AP，Viola L，et al.TFEB， SIRT1， CARM1， Beclin-1 expression and PITX2 methylation in breast cancer chemoresistance： a retrospective study [J].BMC Cancer，2021，21（1）：1118.

[10]Kwon JH，Ahn KS，Moon YH，et al.AROS Is a Significant Biomarker for Tumor Aggressiveness in Non-cirrhotic Hepatocellular Carcinoma [J].J Korean Med Sci，2015，30（9）：1253-1259.

[11]Xia J，Luo Q，Huang S，et al.Alisol B 23-acetate-induced HepG2 hepatoma cell death through mTOR signaling-initiated G1 cell cycle arrest and apoptosis：a quantitative proteomic study[J].Chinese Journal of Cancer Research，2019，31（2）：375.

[12]Jiang W，Zhang C，Kang Y，et al.MRPL42 is activated by YY1 to promote lung adenocarcinoma progression [J].J Cancer，2021，12（8）：2403-2411.

[13]Shen C，Song YH，Xie Y，et al.Downregulation of HADH promotes gastric cancer progression via Akt signaling pathway [J].Oncotarget，2017，8（44）：76279-76289.

[14]Jiang H，Chen H，Wan P，et al.Decreased expression of HADH is related to poor prognosis and immune infiltration in kidney renal clear cell carcinoma [J].Genomics，2021，113（6）：3556-3564.

[15]Karimi Dermani F，Gholamzadeh Khoei S，Afshar S，et al.The potential role of nucleophosmin （NPM1） in the development of cancer[J].J Cell Physiol，2021，236（11）：7832-7852.

[16]Qin G，Wang X，Ye S，et al.NPM1 upregulates the transcription of PD-L1 and suppresses T cell activity in triple-negative breast cancer [J].Nat Commun，2020，11（1）：1669.

[17]Muluhngwi P，Klinge CM.Identification and Roles of miR-29b-1-3p and miR29a-3p-Regulated and Non-Regulated lncRNAs in Endocrine-Sensitive and Resistant Breast Cancer Cells [J].Cancers （Basel），2021，13（14）：3530.

收稿日期：2023-02-12；修回日期：2022-02-27

編輯/肖婷婷

基金項目：國家自然科學基金資助項目（編號：81703557）

作者簡介：董春濤（1997.9-），男，山東菏澤人，碩士研究生，主要從事腫瘤分子生物學研究

通訊作者：石曉（1990.9-），女，江蘇連云港人，博士，講師，主要從事腫瘤分子生物學研究