流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兒童流感淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞變化的研究

黃劼 袁雯 陶瑩

流行性感冒簡(jiǎn)稱流感，是臨床上兒科、急診常見(jiàn)的一種疾病，是流感病毒引起的一種急性呼吸道疾病，屬于丙類傳染病[1]。流感一般表現(xiàn)為急性起病，潛伏期通常為1 ～7 d，多為2 ～4 d，臨床癥狀以高熱、乏力、頭痛、全身酸痛等全身中毒癥狀較重，而呼吸道癥狀（鼻塞、流鼻涕、咽喉痛、干咳等）較輕為主要特征[2-3]。流感嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)呼吸衰竭、膿毒癥休克、急性壞死性腦病、心力衰竭等情況，對(duì)患者心、肝、腎等多臟器功能造成嚴(yán)重的損傷，影響身體健康以及生命安全[4]。目前常見(jiàn)的流感主要有兩種類型，即甲型流感和乙型流感，而人們感染的主要是甲型流感病毒中的甲1 亞型流感病毒（influenza virus of H1N1 sub type，H1N1）、甲3 亞型流感病毒（influenza virus of H3N2 sub type，H3N2）亞型以及乙型流感病毒中的維多利亞流感病毒（Victoria）和乙型山形流感病毒（Yamagata）系。所有5 歲以下的兒童都被公認(rèn)為是重癥流感的高危人群，但是2 歲以下的兒童患流感的風(fēng)險(xiǎn)最高，6 個(gè)月以下的嬰兒因流感住院率和病死率最高[5]。孕婦、嬰幼兒、老年人和慢性基礎(chǔ)疾病等高危人群，患流感后出現(xiàn)嚴(yán)重疾病和病死的風(fēng)險(xiǎn)均較高。兒童感染流感后易出現(xiàn)高熱、腹瀉、嘔吐、呼吸暫停等，對(duì)患兒的生長(zhǎng)發(fā)育、免疫功能、生命安全造成嚴(yán)重的威脅。因此，明確兒童流感感染病毒的過(guò)程以及患兒機(jī)體免疫系統(tǒng)響應(yīng)的過(guò)程，對(duì)于臨床治療兒童流感，降低并發(fā)癥的發(fā)生，保障良好預(yù)后具有非常重要的價(jià)值和意義。基于此，本研究旨在探討流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兒童流感成熟T 淋巴細(xì)胞（mature T lymphocytes，CD3+）、誘導(dǎo)性T 細(xì)胞/輔助性T 細(xì)胞（helper T cells，CD4+）、抑制性T 細(xì)胞/細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（cytotoxic T cells，CD8+）、T 淋巴細(xì)胞亞群和自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）表達(dá)水平的變化，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2022 年4 月—2023 年4 月于湘潭市第一人民醫(yī)院兒科就診的20 例流感患兒作為此次研究的觀察組，再選取同時(shí)期于湘潭市第一人民醫(yī)院進(jìn)行體檢的20 名健康兒童作為對(duì)照組。其中對(duì)照組男童10 名，女童10 名；年齡4 ～12 歲，平均（8.65±2.47）歲；身體質(zhì)量指數(shù)20 ～25 kg/m2，平均（22.86±1.37）kg/m2。觀察組男童11 例，女童9 例；年齡4 ～12 歲，平均（8.70±2.42）歲；身體質(zhì)量指數(shù)20 ～25 kg/m2，平均（22.84±1.35）kg/m2；病程3 ～7 d，平均（5.45±1.12）d；流感類型：甲型流感12 例，乙型流感8 例。兩組兒童性別、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）觀察組兒童經(jīng)臨床診斷均符合《兒童流感診斷與治療專家共識(shí)（2020 年版）》[6]中對(duì)兒童流感的診斷標(biāo)準(zhǔn)。（2）年齡4 ～12 歲。（3）所有兒童及監(jiān)護(hù)人均知此次研究?jī)?nèi)容并簽訂知情同意書。（4）入院就診前均未服用過(guò)任何藥物。（5）個(gè)人資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）普通感冒、其他上呼吸道感染、其他下呼吸道感染患兒。（2）精神煩躁、哭鬧不止不配合研究者。（3）未獲得兒童監(jiān)護(hù)人知情同意。（4）免疫系統(tǒng)先天性異常或障礙者。（5）合并心、肝、腎等臟器惡性腫瘤或血液系統(tǒng)疾病者。

1.2 方法

研究開(kāi)始前1 d 告知兩組兒童及其監(jiān)護(hù)人次日凌晨須空腹，檢查開(kāi)始前禁止進(jìn)食和飲水。醫(yī)護(hù)人員采集兩組兒童清晨空腹外周血2 mL，置于乙二胺四乙酸二鉀真空采血管中備用，隨后使用BriCyte E6 流式細(xì)胞儀（邁瑞）分別檢測(cè)兩組兒童的CD3+、CD4+、CD8+、T 淋巴細(xì)胞亞群和NK 細(xì)胞表達(dá)水平，所有實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)操作均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室、試劑盒、儀器要求進(jìn)行操作，記錄檢測(cè)結(jié)果。其中兒童體內(nèi)CD3+正常水平為61%～85%、CD4+正常水平為28%～58%、CD8+正常水平為19%～48%、T 淋巴細(xì)胞亞群正常表達(dá)水平為20%～40%，NK 細(xì)胞正常表達(dá)水平為7%～25%。

1.3 觀察指標(biāo)

比較兩組兒童淋巴細(xì)胞亞群和NK 細(xì)胞表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與對(duì)照組兒童相比，觀察組患兒的CD3+、CD4+、NK細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平均明顯偏低（P＜0.05）；與對(duì)照組兒童相比，觀察組患兒的CD8+表達(dá)水平均明顯偏高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 觀察組與對(duì)照組兒童淋巴細(xì)胞亞群和NK 細(xì)胞表達(dá)水平比較（%，±s）

表1 觀察組與對(duì)照組兒童淋巴細(xì)胞亞群和NK 細(xì)胞表達(dá)水平比較（%，±s）

組別 CD3+ CD4+ CD8+ NK 細(xì)胞 T 淋巴細(xì)胞對(duì)照組（n ＝20） 72.42±7.04 45.69±10.23 25.33±9.75 56.45±7.11 66.88±9.11觀察組（n ＝20） 61.44±7.43 36.76±10.48 34.54±8.54 42.21±6.23 60.03±10.23 t 值 4.797 2.727 3.178 6.737 2.236 P 值 ＜0.001 0.010 0.003 ＜0.001 0.031

3 討論

流感病毒容易發(fā)生變異，主要通過(guò)飛沫以及接觸傳染，傳染性較強(qiáng)，人群普遍易感，發(fā)病率較高，歷史上在全世界引起多次暴發(fā)性流行，是全球關(guān)注的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題[7-8]。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，每年季節(jié)性流感在全球可導(dǎo)致300 萬(wàn)～500 萬(wàn)重癥病例，29 萬(wàn)～65 萬(wàn)病死。流感在中國(guó)以冬春季節(jié)多見(jiàn)，人們感染流感后臨床表現(xiàn)以全身中毒癥狀為主，其次是呼吸道癥狀，而兒童發(fā)熱程度通常高于成年人，患乙型流感時(shí)惡心、嘔吐、腹瀉等消化道癥狀較成年人多見(jiàn)[9-10]。目前，臨床上普遍認(rèn)為流感的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，認(rèn)為主要是流感病毒進(jìn)入人體呼吸道后，與呼吸道表面纖毛柱狀上皮細(xì)胞的特殊受體結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞中，然后在細(xì)胞內(nèi)完成自我復(fù)制，新的病毒顆粒不斷被釋放并播散再感染更多其他的細(xì)胞，進(jìn)而引起機(jī)體出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、肌痛等全身癥狀，甚至引起病毒性肺炎、腦病等[11-12]。此外，有諸多學(xué)者認(rèn)為流感的發(fā)病還與環(huán)境因素（氣候變量、經(jīng)緯度等）、個(gè)體因素（基礎(chǔ)慢性疾病、吸煙、勞累、壓力大等）、易發(fā)生重癥的高危人群（年齡＜5 歲或≥65 歲，肥胖、妊娠、圍生期婦女等）等因素密切聯(lián)系[13-14]。

兒童是流感暴發(fā)的高危人群，臨床醫(yī)護(hù)工作者以及監(jiān)護(hù)人應(yīng)該引起高度重視。兒童感染流感病毒后，病毒通過(guò)血凝素與呼吸道上皮細(xì)胞含有唾液酸受體的細(xì)胞表面進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)而感染[15-16]。流感病毒侵襲機(jī)體后可以誘發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴，導(dǎo)致全身出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征以及多臟器功能衰竭，對(duì)兒童身心的生長(zhǎng)發(fā)育造成嚴(yán)重的影響[17-18]。目前，臨床上普遍認(rèn)為兒童感染流感病毒的發(fā)病機(jī)制主要是病原體直接侵害機(jī)體導(dǎo)致的，其次還認(rèn)為其與兒童機(jī)體免疫功能紊亂有密切的關(guān)系[19]。目前，有部分研究指出，機(jī)體感染流感后淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞水平會(huì)出現(xiàn)明顯的變化，致使免疫功能出現(xiàn)紊亂，影響身體健康，危及生命安全[20]。

T 淋巴細(xì)胞簡(jiǎn)稱T 細(xì)胞，是由來(lái)源于骨髓的淋巴干細(xì)胞，在胸腺中的胸腺素的誘導(dǎo)下，經(jīng)過(guò)一系列有序的分化過(guò)程，逐漸在胸腺發(fā)育成熟為能夠識(shí)別何種抗原的T 細(xì)胞庫(kù)，通過(guò)淋巴以及血液循環(huán)而分布到全身的免疫器官和組織中發(fā)揮免疫功能[21]。T 細(xì)胞是相當(dāng)復(fù)雜的不均一體，又在體內(nèi)不斷地更新，在同一時(shí)間可以存在不同發(fā)育階段或功能的亞群，但是其分類原則和命名尚未統(tǒng)一[22]。臨床上根據(jù)免疫應(yīng)答中的功能不同，將T 細(xì)胞分成若干亞群：CD4+、CD8+等。CD3+是指成熟的T 淋巴細(xì)胞，能夠與T 細(xì)胞抗原受體（T cell antigen receptor，TCR）結(jié)合形成TCR-CD3+復(fù)合體分子，然后將抗原信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)。CD4+、CD8+能夠分別于主要組織相容性抗原-Ⅱ（Major histocompatibility antigen-Ⅱ，MHC-Ⅱ）、主要組織相容性抗原-Ⅰ（Major histocompatibility antigen-Ⅰ，MHC-Ⅰ）分子結(jié)合，穩(wěn)定TCR 與抗原肽-MHC 分子復(fù)合物的結(jié)合，促進(jìn)體內(nèi)激活信號(hào)的傳遞[23]。NK 細(xì)胞不同于T、B 細(xì)胞，它是一類不需要預(yù)先致敏就可以非特異性的殺傷腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的淋巴細(xì)胞[24]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組兒童相比，觀察組患兒的CD3+、CD4+、NK 細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平均明顯偏低（P＜0.05）；與對(duì)照組兒童相比，觀察組患兒的CD8+表達(dá)水平均明顯偏高（P＜0.05）。說(shuō)明經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)流感兒童均存在明顯的體液以及細(xì)胞免疫功能紊亂。分析其原因可能與流感患兒感染流感病毒后，體內(nèi)輔助性T 細(xì)胞受到侵襲和損傷，導(dǎo)致CD4+細(xì)胞、CD3+細(xì)胞分化過(guò)程受阻，無(wú)法正常分化，且損傷加重，致使T細(xì)胞的活性受到明顯的抑制，增加CD8+的數(shù)量，最終導(dǎo)致免疫功能出現(xiàn)紊亂。此外，流感病毒侵襲機(jī)體免疫器官后，導(dǎo)致機(jī)體無(wú)法正常釋放T 淋巴細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致總的T 淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯降低，免疫功能損傷并受到抑制，機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，又進(jìn)一步影響免疫功能，加重流感病毒對(duì)機(jī)體的侵襲和損傷，形成惡性循環(huán)。當(dāng)機(jī)體受到流感病毒的侵襲后，機(jī)體內(nèi)免疫應(yīng)答會(huì)發(fā)生相應(yīng)反應(yīng)，即NK 細(xì)胞被激活，然后與Fc 段進(jìn)行結(jié)合，發(fā)揮非特異性的殺傷作用，直接殺死或破壞被流感病毒侵襲或感染的靶細(xì)胞。文章中體現(xiàn)了《兒童流感診斷與治療專家共識(shí)（2020 年版）》[6]的臨床參考。

綜上所述，流感兒童均存在明顯的體液以及細(xì)胞免疫功能紊亂，主要表現(xiàn)為CD3+、CD4+、NK 細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平下降，CD8+表達(dá)水平上升，可為流感患兒的臨床治療、減少并發(fā)癥及預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)。