3種苯二氮類藥物對幽門螺桿菌的抗菌作用及其機制

陳旭 張冬 唐麗華 仲莉君 張娟 李玉蘭

摘要：目的? 探究苯二氮類藥物對幽門螺桿菌（Hp）的抗菌作用及其機制分析。方法? 以Hp國際標準菌株ATCC43504作為實驗菌株，苯二氮類藥物地西泮、咪達唑侖、瑞馬唑侖為實驗藥物，阿莫西林、克拉霉素為陽性對照，注射用水為陰性對照，采用藥敏紙片法測量每種藥物的抑菌圈。采用抗菌效能檢測藥物對Hp的最低抑菌濃度（MIC）及最低殺菌濃度（MBC）。配置Hp菌懸液，分別用地西泮（地西泮組）、咪達唑侖（咪達唑侖組）處理，不加藥的菌懸液作為對照組，使用全自動生化分析儀檢測各組藥物干預前（T0）及干預后1（T1）、2（T2）、3（T3）、4（T4）、5（T5）、6（T6）、7 h（T7）菌懸液中K+濃度。提取Hp脲酶，分別采用1/2 MIC地西泮、MIC地西泮、2 MIC地西泮、1/2 MIC咪達唑侖、MIC咪達唑侖、2 MIC咪達唑侖、1 mg/ml乙酰氧肟酸、注射用水處理，酚紅顯色法檢測各組pH值從6.8升至7.7所需的時間。結果? 地西泮、咪達唑侖、瑞馬唑侖、阿莫西林、克拉霉素、注射用水對Hp的抑菌圈分別為52.3、42.7、6.0、72.3、60.8、6.0 mm。地西泮、咪達唑侖對Hp的MIC分別為12.5、25.0 μg/ml，MBC分別為25、50 μg/ml。與T0比較，T1～T7地西泮組、咪達唑侖組和對照組的K+濃度均明顯升高（P均＜0.01）；T1～T4地西泮組和咪達唑侖組的K+濃度明顯高于對照組（P均＜0.01）。1/2 MIC地西泮組、MIC地西泮組、2 MIC地西泮組、1/2 MIC咪達唑侖組、MIC咪達唑侖組、2 MIC咪達唑侖組對脲酶活性的抑制時間分別為（39.86±5.11）、（36.52±6.65）、（38.58±4.83）、（39.25±6.19）、（36.36±4.61）、（35.81±6.18）min，明顯短于乙酰氧肟酸組（P均＜0.01），但與注射用水組差異無統計學意義（P均＞0.05）。結論 ?苯二氮類藥物地西泮、咪達唑侖對Hp有良好的抗菌作用，其抗菌機制可能與Hp細胞裂解有關，與脲酶抑制無關。

關鍵詞：幽門螺桿菌；苯二氮類；抗菌

中圖分類號： R517.9；R971+.3? 文獻標志碼： A? 文章編號：1000-503X（2023）05-0783-06

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15651

Inhibitory Effects and Mechanisms of Three Benzodiazepines on Helicobacter pylori

CHEN Xu1，ZHANG Dong2，TANG Lihua3，ZHONG Lijun3，ZHANG Juan3，LI Yulan4

1The First School of Clinical Medicine，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China

2Department of Gastroenterology，3Department of Microbiology，Jiuquan City Peoples Hospital，Jiuquan，Gansu 735000，China

4Department of Anesthesiology，The First Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730000，China

Corresponding author：LI Yulan? Tel：13519625065，E-mail：jasm@sina.com

ABSTRACT：Objective? To explore the inhibitory effects and mechanisms of benzodiazepines on Helicobacter pylori （Hp）.Methods? The Hp international standard strain ATCC43504 was treated with benzodiazepines diazepam，midazolam，and remimazolam，respectively.The treatments with amoxicillin and clarithromycin were taken as the positive controls，and that with water for injection as the negative control.The inhibition zone of each drug was measured by the disk diffusion method.The minimum inhibitory concentration（MIC）and minimum bactericidal concentration（MBC）of each drug against Hp were determined.Hp suspension was configured and treated with diazepam and midazolam，respectively.The bacterial suspension without drug added was used as the control group.The concentration of K+ in each bacterial suspension was measured by an automatic biochemical analyzer before drug intervention（T0）and 1（T1），2（T2），3（T3），4（T4），5（T5），6（T6），and 7 h（T7）after intervention.Hp urease was extracted and treated with 1/2 MIC diazepam，1 MIC diazepam，2 MIC diazepam，1/2 MIC midazolam，1 MIC midazolam，2 MIC midazolam，1 mg/ml acetohydroxamic acid，and water for injection，respectively.The time required for the rise from pH 6.8 to pH 7.7 in each group was determined by the phenol red coloring method.Results? The inhibition zones of diazepam，midazolam，remimazolam，amoxicillin，clarithromycin，and water for injection against Hp were 52.3，42.7，6.0，72.3，60.8，and 6.0 mm，respectively.Diazepam and midazolam showed the MIC of 12.5 μg/ml and 25.0 μg/ml and the MBC of 25 μg/ml and 50 μg/ml，respectively，to Hp.The concentrations of K+ in the diazepam，midazolam，and control groups increased during T1-T7 compared with those at T0（all P<0.01）.The concentration of K+ in diazepam and midazolam groups during T1-T4 was higher than that in the control group（all P<0.01）.The time of inhibiting urease activity in the 1/2 MIC diazepam，1 MIC diazepam，2 MIC diazepam，1/2 MIC midazolam，1 MIC midazolam，and 2 MIC midazolam groups was（39.86±5.11），（36.52±6.65），（38.58±4.83），（39.25±6.19），（36.36±4.61），and（35.81±6.18）min，respectively，which were shorter than that in the acetohydroxamic acid group（all P<0.01）and had no significance differences from that in the water for injection group（all P>0.05）.Conclusion? Diazepam and midazolam exerted inhibitory effects on Hp，which may be related to the cleavage of Hp cells rather than inhibiting urease.

Key words：Helicobacter pylori；benzodiazepines；antibacterial

Acta Acad Med Sin，2023，45（5）：783-788

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）感染與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌以及胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤等多種胃部疾病密切相關，也可引起難治性缺鐵性貧血、難治性蕁麻疹等消化道以外疾病。目前認為Hp感染是導致胃癌的主要危險因素［1］。根除Hp感染是預防和治療胃部疾病的重要途徑。但隨著Hp根治治療的廣泛開展，其耐藥性逐漸增加，如何有效提高Hp根除率仍面臨著挑戰［2］，探尋新的抗Hp藥物具有重要的臨床意義［3］。苯二氮類藥物是臨床鎮靜、催眠的常用藥物之一。1995年英國學者Magee等［4］發現含有咪達唑侖的注射器在使用數小時后微生物培養呈陰性，之后Ayoglu等［5］發現咪達唑侖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌等具有殺菌作用。近期又有學者發現一些新合成的苯二氮類化合物具有廣泛的抗菌活性［6-7］。然而苯二氮藥物是否能殺滅或抑制Hp目前國內外缺乏相關報道。本研究擬采用Hp國際標準菌株，觀察苯二氮類藥物對Hp的抗菌作用，并探討其抗菌效能和機制。

材料和方法

菌株、試劑和儀器? Hp菌株ATCC43504購自商城北納創聯生物科技有限公司，該菌株為美國臨床實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）細菌藥敏試驗執行指南推薦的質控菌株。地西泮（批號：1501531）購自天津金耀藥業有限公司，咪達唑侖（批號：MZ210608）購自江蘇恩華藥業股份有限公司，苯磺酸瑞馬唑侖（批號：20T04081）購自宜昌人福藥業有限公司，哥倫比亞血平板、Mueller-Hinton血平板、Mueller-Hinton瓊脂粉、腦心浸液肉湯、羊血均購自英國OXOID公司，微需氧產氣袋、密封箱購自日本三菱公司，尿素、酚紅、乙酰氧肟酸、PBS緩沖液購自合肥博美生物科技公司。生物安全柜購自力康精密科技（上海）有限公司，恒溫箱購自北京福意聯醫療設備有限公司，比濁儀購自美國PhoenixSpec公司，全自動生化分析儀購自美國Beckman公司，超低溫冰柜購自日本三菱公司，微量移液器購自德國Eppendorf公司。

菌株復蘇和鑒定? 取出-80 ℃冰箱中凍存的Hp菌株，置于37 ℃水浴箱中解凍，吸取100 μl均勻涂布于哥倫比亞血平板上，將血平板倒置，置于37 ℃、微需氧環境（5% O2、10% CO2和85% N2）中培養3 d后觀察菌落，并通過革蘭氏染色、氧化酶試驗、尿素酶試驗鑒定［8］，同時收集復蘇后的菌落，PCR擴增產物進行雙向測序，在美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數據庫進行BLAST-N對比。將鑒定無誤的細菌在上述環境中傳代增菌，用于后續實驗。

藥物篩選? 按照Matuschek等［9］的方法制作藥敏紙片，將10片空白藥敏紙片分別置入濃度為2 mg/ml的地西泮、咪達唑侖、瑞馬唑侖溶液和注射用水中，30 min后將藥敏紙片置入另一干燥無菌平皿中，室溫下放置15 min待其干燥。以25 μg/片阿莫西林和15 μg/片克拉霉素藥敏紙片作為陽性對照，注射用水藥敏紙片作為陰性對照。配制0.5麥氏單位的菌懸液，取100 μl均勻涂布于Mueller-Hinton血平板，室溫下放置15 min。使用無菌鑷將干燥的藥敏紙片貼于已接種Hp的平板上，每種藥物貼3個平板，在37 ℃、微需氧環境中培養3 d后，觀察并測量抑菌圈直徑。依據CLSI M45-A3（2015）中的標準，抑菌圈＞17 mm定義為Hp對該藥敏感。

抗菌效能檢測? 將篩選出的Hp敏感藥物，制作0、3.125、6.250、12.500、25.000、50.000、100.000 mg/ml濃度的含藥培養皿［10-11］，并接種100 μl濃度為0.5麥氏單位的菌懸液，每種藥物濃度接種3個培養皿，在37 ℃、微需氧環境中培養3 d，觀察Hp生長情況，記錄完全抑制Hp生長的培養基藥物最低濃度，即最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。將大于等于MIC的培養皿用10%甘油洗脫，涂布于不含藥的空白培養皿上，培養3 d，觀察Hp生長情況，記錄完全殺死Hp的培養皿所對應的第1批培養皿的藥物最低濃度，即最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。

細胞滲漏試驗? 配制0.5麥氏單位的Hp菌懸液，分別與12.5 μg/ml地西泮（地西泮組）和25 μg/ml咪達唑侖（咪達唑侖組）以1∶1比例混合，配成1/2 MIC的藥菌混合液，以不加藥的菌懸液作為對照組，加入24孔板中，每孔2 ml，每組重復3次［12］。將24孔板置于37 ℃、微需氧環境中培養，采用全自動生化分析儀檢測各組藥物干預前（T0）、干預后1（T1）、2（T2）、3（T3）、4（T4）、5（T5）、6（T6）和7 h（T7）菌懸液中K+濃度。

脲酶試驗? 按照Yu等［13］方法提取Hp脲酶，將50 ml Hp菌懸液置于離心管中，5 000 g、4 ℃離心收集Hp，用磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）洗滌2次，將沉淀的Hp置于-80 ℃保存1 d，取出恢復至室溫，加入3 ml蒸餾水和蛋白酶抑制劑，超聲波振蕩1 min，15 000 g、4 ℃離心10 min，取上清液透析除鹽，所得到的脲酶溶液加入等體積的甘油后于4 ℃儲存。分別將1/2 MIC地西泮、MIC地西泮、2 MIC地西泮、1/2 MIC咪達唑侖、MIC咪達唑侖、2 MIC咪達唑侖、1 mg/ml乙酰氧肟酸、注射用水加入脲酶中，每組重復3次，37 ℃培養箱中孵育1 h，加入緩沖液、尿素和酚紅，檢測各組pH值從6.8升至7.7所需的時間。脲酶濃度為14 U/ml（對應2.0麥氏單位Hp菌懸液）。

統計學處理? 采用SPSS 25.0軟件，符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內比較采用重復測量設計的方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

Hp復蘇與鑒定? 在涂有Hp的哥倫比亞血平板上，肉眼可見菌落呈灰白色半透明狀，表面濕潤，稍凸于培養基表面；挑取單個菌落做革蘭氏染色，鏡檢菌體呈海鷗狀、彎曲形短桿菌；氧化酶試驗顯示，沾有菌落的氧化酶試紙1 min內呈現藍紫色；快速尿素酶試驗顯示，當將菌懸液加入以酚紅為指示劑的尿素試劑中，試劑由黃色變紅色。復蘇的菌落經16S擴增測序，在NCBI進行BLAST-N對比，結果顯示與Hp一致性為99.92%（圖1）。

藥物篩選? 地西泮、咪達唑侖、瑞馬唑侖、阿莫西林、克拉霉素、注射用水對Hp的抑菌圈分別為52.3、42.7、6.0、72.3、60.8、6.0 mm（圖2）。

抗菌效能比較? 地西泮和咪達唑侖對Hp的MIC分別為12.5、25.0 μg/ml，MBC分別為25、50 μg/ml。

不同藥物治療組K+濃度比較? 與T0比較，T1～T7地西泮組、咪達唑侖組和對照組的K+濃度均明顯升高（P均＜0.01）；T1～T4地西泮組和咪達唑侖組的K+濃度明顯高于對照組（P均＜0.01）。地西泮組和咪達唑侖組K+濃度在2 h內快速升高，3 h達峰，之后趨于穩定；對照組K+濃度1 h后逐漸升高，直至5 h后趨于穩定（圖3）。

脲酶反應時間? 1/2 MIC地西泮組、MIC地西泮組、2 MIC地西泮組、1/2 MIC咪達唑侖組、MIC咪達唑侖組、2 MIC咪達唑侖組對脲酶活性的抑制時間分別為（39.86±5.11）、（36.52±6.65）、（38.58±4.83）、（39.25±6.19）、（36.36±4.61）、（35.81±6.18）min，明顯短于乙酰氧肟酸組［（88.26±5.69）min］（P均＜0.01），但與注射用水組［（37.72±4.34）min］差異無統計學意義（P均＞0.05）。

討論

Hp感染是一個嚴重的全球性問題。世界衛生組織已經將Hp列為Ⅰ類致癌因子［14］，因此根治Hp對于預防Hp引起的一系列疾病具有重要的臨床意義。目前，抗生素治療Hp的效果受到了耐藥性問題的限制，尋找或者合成新型抗Hp藥物具有重要的研究意義。苯二氮類藥物是一類常用的鎮靜麻醉藥，在臨床上已被廣泛應用于鎮靜、催眠、抗焦慮以及遺忘等領域。本研究結果顯示，地西泮、咪達唑侖對Hp有顯著抗菌作用。

據報道，某些抗抑郁藥和抗精神病類藥物具有抑制部分細菌和真菌的作用［15-16］。研究表明，舍曲林具有抗Hp作用，其MIC為2～8 μg/ml［17］。另一項研究顯示，咪達唑侖對金黃色葡萄球菌和糞腸球菌的MIC分別為256 μg/ml和128 μg/ml［5］。此外，Kathwate等［18］的研究結果表明地西泮和咪達唑侖對白色念珠菌的MIC分別為400、100 μg/ml。本研究結果顯示地西泮和咪達唑侖對Hp的MIC分別為12.5、25 μg/ml。從MIC值可以看出，與其他細菌相比，這兩種藥物對Hp的抗菌作用更強，其效能類似于甲硝唑［19］，但略低于阿莫西林［19］。盡管靜脈注射的苯二氮類藥物很難達到產生抗菌效應所需的血藥濃度，但很多患者通過口服地西泮或咪達唑侖進行治療后，在胃內產生較高的藥物濃度，可以形成抑制或殺滅Hp的環境。由于普通混合食物的胃排空時間通常為4～6 h，而地西泮、咪達唑侖1～3 h內即可殺滅Hp細胞，因此達到抗菌效果。

本研究細胞滲漏試驗結果顯示，地西泮和咪達唑侖干預的菌懸液在用藥1～3 h K+濃度快速升高，提示地西泮、咪達唑侖治療可以破壞Hp的細胞膜，顯著減少Hp細胞數量，并導致K+大量滲漏。而未加藥的空白菌懸液K+濃度在1 h內緩慢上升，之后在5 h達到峰值并趨于穩定，這可能是由于Hp缺乏適宜的氣體及溫度環境所致，隨著時間的推移，細菌逐漸死亡。

Hp脲酶是Hp與其他胃腸道微生物區分的主要特征之一，對于Hp的生存和定植至關重要［20］。脲酶能夠催化尿素水解，產生NH3、CO2和HCO3，其中NH3可以中和胃酸，為Hp在強酸環境中生存創造近中性的條件。脲酶是治療Hp感染的重要靶點［21］。既往文獻報道，咪唑類化合物具有脲酶抑制的活性［22-23］。由于本研究的干預藥物地西泮、咪達唑侖含有咪唑環結構，故采用脲酶抑制試驗，以探究這兩種藥物對Hp脲酶的抑制作用。實驗結果表明，地西泮和咪達唑侖干預后的反應體系pH值從6.8上升至7.7所需時間與注射用水基本一致，遠遠短于陽性對照乙酰氧肟酸，說明這兩種藥物的抗菌作用與脲酶抑制無關。

2008年土耳其麻醉醫師Ayoglu等［5］發現咪達唑侖具有抗菌作用，并認為這一作用是由于藥液的低pH值而非藥物本身的藥理作用所導致。但本研究中咪達唑侖的pH值為2.9～3.7，瑞馬唑侖的pH值為3.0～4.0，兩種藥物pH值相似，然而抑菌效果卻完全不同（咪達唑侖抗菌作用明顯，而瑞馬唑侖無效），因此，可以初步排除低pH值是咪達唑侖產生抗菌作用的原因。

本研究尚存在不足之處：（1）僅體外證實了地西泮、咪達唑侖的抗Hp作用，未進行動物實驗驗證；（2）僅采用細胞滲漏試驗證實藥物干預后Hp細胞裂解，對于抗菌機制、作用通路及靶點未進行更深一步的探索，未來擬通過蛋白質組學技術分析地西泮、咪達唑侖對Hp的抗菌機制。

綜上，本研究結果表明，苯二氮類藥物地西泮、咪達唑侖對Hp具有良好的抗菌作用，其機制與Hp的細胞裂解有關，與脲酶抑制無關。地西泮和咪達唑侖可能成為Hp的潛在治療藥物，并為抗Hp新藥的研發提供參考。

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（收稿日期：2023-04-25）