游泳調控NF-κB 信號通路介導肥胖大鼠睪丸自噬干預炎癥

李 可，李寧川，林 晨，夏 俊，徐美琪，孫 蕾，何 柳，王啟航

（1.揚州大學體育學院，揚州 江蘇 225127；2.安徽省體育科學研究所，安徽 合肥 230000）

肥胖與許多健康問題有關， 包括生殖功能障礙， 在男性中，肥胖與精子質量下降、睪酮水平下降和睪丸損傷有關［1-3］。在肥胖狀態下，炎癥反應往往被激活，它是一種生物體對各種內外因素的應激反應， 當炎癥反應失控時會導致組織損傷和代謝紊亂，引起各種疾病。 事實證明，肥胖引起的睪丸損傷被認為部分是由炎癥介導的。 由于免疫學和傳染性病因對男性不育癥有很大貢獻［4］，炎癥性不育的作用往往被低估，有研究表明， 在20%的無精癥不育患者睪丸活檢中觀察到免疫細胞浸潤，進一步支持炎癥反應在男性不育中的作用［5］。

NF-κB 信號通路的經典和替代通路是激活NF-κB 以響應不同刺激的兩種不同機制［6］。本研究涉及的信號通路為經典途徑，經典途徑主要調節促炎基因的表達，一旦被激活，該途徑會導致NF-κB 二聚體從細胞質易位到細胞核，并與靶基因啟動子區的位點結合，從而誘導其表達［7］。研究表明，肥胖會導致腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素6（IL-6）等促炎細胞因子的表達增加，激活睪丸組織中的NF-κB 通路［8］。 此外，自噬在調節肥胖致炎細胞因子的產生和釋放發揮重要作用［9］。越來越多的研究證明， 自噬參與雄性生殖系統， 它是一種細胞過程，在維持細胞穩態方面發揮著重要作用［10］。

規律的運動已被證明可以減少睪丸組織中促炎細胞因子TNF-α 等的表達［11］，這可能通過下調參與炎癥和氧化應激的NF-κB 靶基因實現，NF-κB 信號通路在肥胖致睪丸組織損傷中的作用尚未見報道，抑制NF-κB 和提高自噬水平可能是治療肥胖相關生殖功能障礙的潛在治療策略； 有限的研究表明運動對睪丸組織自噬活性具有一定影響［6］，自噬過程廣泛參與機體能量代謝核心器官，如脂肪、骨骼肌、肝臟等，但自噬在機體另一重要器官—睪丸中的研究甚少， 特別是自噬通過運動改善機體睪丸組織脂質代謝方面和炎癥反應方面也鮮有報道。 因此，本研究探討NF-κB 和自噬參與肥胖致睪丸炎癥的作用機制以及運動對睪丸組織產生的影響。

1 材料與方法

1.1 大鼠模型構建及分組

3 周齡雄性SD 大鼠55 只，購于江蘇大學，動物許可證號SYXK（蘇）2019-0044。 體重為140±10 g，將大鼠隨機分為普通對照組（n=25）和高脂膳食組（n=30），對照組大鼠給予普通維持飼料喂養，高脂膳食組給予高脂飼料，飼料均購于江蘇協同生物有限公司。 大鼠在造模期間自由飲水進食。 室溫21～24 ℃，濕度40%～60%，12 h 晝夜循環照明。造模6 周后，大鼠體重增大1/3 且體重高于對照組平均體重的20%則為造模成功。 所有大鼠適應性飼養1 周后， 采用隨機數字法分為正常對照組（NC 組，10 只）、高脂飲食組（HC 組，10 只）；正常運動組（CE組，10 只）；高脂運動組（HE，10 只）。 實驗獲揚州大學實驗動物福利倫理委員會批準。

需要說明的是，在干預過程中3 只大鼠因攻擊行為流失，5 只大鼠難以適應干預實驗環境流失，其中對照組2 只、高脂膳食組6 只，為了減少變量之間潛在的混雜影響，提高研究的精準度，每組采用相同的樣本數量。 普通維持飼料（玉米，魚粉，奶粉，賴氨酸，植物油，食鹽，微量元素混合物，礦物質混合物組成，其中碳水化物62%、脂肪11%、蛋白質27%，熱量為2.69 Kcal/g）；高脂飼料（高脂飼料供能比蛋白質：17.5%、脂肪37%、碳水化合物45.5%，熱量為3.85 Kcal/g）。

1.2 干預方案

NC 組和CE 組普通飼料飼養，HC 組和HE 組高脂飼料飼養。 NC、HC 組不運動，在運動組干預的同時放在相同條件（時間和溫度）泳池的淺水區，排除水的影響；CE 組和HE 組進行中等強度無負重游泳，游泳方案參照前人有所改進［12］，水溫控制在35 ℃左右，第一周適應性游泳，第一天游泳10 min，以后每天遞增10 min 至60 min 停止；第二周游泳60 min，每周干預6 天。 共干預8 周。

1.3 實驗取材和樣本處理

干預結束后稱重，禁食12 h 正常飲水，于次日清晨用50 mg/kg 劑量注射2%的戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠， 測量大鼠體重、體長，然后腹部取血10 ml，4℃靜置1 h 后，相同溫度3 500 r/min 離心15 min 制備血清保存于-20 ℃冰箱，用于ELISA 檢測；取出雙側睪丸稱濕重，用0.1%DEPC 水處理的無RNA 污染的冰生理鹽水漂洗， 放入液氮冷凍再入無RNA 酶的EP 管中，放入-80 ℃冰箱保存待用。

1.4 指標測試與方法

1.4.1 ELISA 檢測指標與方法

ELISA 檢測大鼠血清中甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）以及睪丸組織中IL-6、TNF-α、NF-κB 水平， 取睪丸組織加入適量生理鹽水搗碎。3 000 r/min 離心10 min 取上清制成組織勻漿。 具體操作方法參照試劑盒說明書規范進行， 試劑購自南京諾唯贊生物有限公司。

1.4.2 RT-PCR 檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、P62mRNA 的表達

采用Triol 法提取睪丸中的RNA，使用逆轉錄試劑盒將所提取的睪丸RNA 在核酸擴增儀中反轉錄獲取cDNA， 利用熒光定量PCR 儀進行樣本cDNA 的擴增和熒光定量檢測。

1.4.3 Western blot 檢測睪丸組織IκBα、NF-κB p65水平

-80℃取大鼠睪丸組織，收集提取液，加入蛋白上樣緩沖液，SDS-PAGE 跑膠、轉膜，轉印蛋白的膜用5%脫脂奶粉37℃封閉1.5 h，將膜與IκBα、磷酸化IκBα、GAPDH、NF-κB p65 的一抗4 ℃孵育過夜，然后使用HRP 標記的二抗37 ℃孵育1.5 h，最后加入ECL 曝光成像。

1.4.4 透射電鏡觀察睪丸組織超微結構變化

利用透射電鏡檢測自噬體，將實驗動物處死后，快速取出睪丸組織，于0.9%生理鹽水中漂洗3 次，然后進行睪丸組織前后固定，固定結束后進行脫水、滲透，最后進行包埋、聚合，切片由揚州大學生物測試中心協助完成，保存以待電鏡觀察成像。

1.5 統計學處理

用SPSS 27.0 統計軟件進行分析，采用單因素方差分析和配對樣本t檢驗分析，結果用均數±標準差（）來表示，p<0.05 說明差異有統計學意義。

2 研究結果

2.1 大鼠體重、體長及Lee's 指數

與NC 組相比，CE 組體重和Lee's 下降（p<0.01）；HC 組大鼠體重和Lee's 指數升高（p<0.01）。 與HC 組相比，8 周游泳運動使大鼠體重、Lee's 指數下降（p<0.05），各組體長均無統計學差異，見圖1。

圖1 各組大鼠體重、體長和Lee's 指數水平

2.2 大鼠血清脂代謝指標變化

與NC 組比較，CE 組TG 含量升高（p<0.01），TC 含量降低（p<0.01），LDL 含量降低（p<0.05），HDL 含量呈現下降趨勢但差異無統計學意義；HC 組TG、TC、LDL 含量均升高（p<0.01），HDL 含量降低 （p<0.01）。 與HC 組比較，HE 組TG 含量降低（p<0.01），TC、LD 含量降低（p<0.05），LDL 含量降低（p<0.05），HDL 含量呈現下降趨勢但差異無統計學意義，見圖2。

圖2 各組大鼠血脂水平

圖3 各組大鼠睪丸組織炎癥因子水平

圖4 各組大鼠睪丸組織自噬水平

圖5 各組大鼠睪丸組織IκB-α 磷酸化及核內NF-κB p65 含量

圖6 各組大鼠睪丸組織超微組織結構

圖7 各組大鼠睪丸組織NF-κB、IL-6、TNF-α、LC3-II/LC3-I 和p62 之間的相關性

表1 RT-PCR 反應引物序列

2.3 實驗大鼠睪丸組織NF-κB、IL-6、TNF-α 變化

與NC 組相比，CE 組NF-κB、IL-6 水平降低 （p<0.05），TNF-α 水平下調， 但差異無統計學意義；HC 組NF-κB、IL-6水平均有升高（p<0.01），TNF-α 水平升高（p<0.05），與HC 組相比，HE 組NF-κB、IL-6 水平均降低 （p<0.05），TNF-α 水平降低（p<0.01）。

2.4 實驗大鼠睪丸組織p62、LC3mRNA 水平

與NC 組相比，CE 組LC3-II/LC3-I 升高，p62mRNA 含量下降， 但差異無統計學意義；HC 組LC3-II/LC3-I 降低 （p<0.05），P62mRNA 含量增加 （p<0.05）； 與HC 組相比，HE 組LC3-II/LC3-I 升高（p<0.01），p62mRNA 含量降低（p<0.01）。

2.5 實驗大鼠睪丸組織IκBα 磷酸化、NF-κB p65含量

大鼠游泳8 周后，Western blot 結果顯示， 與NC 組相比，HC 組IκBα 磷酸化及細胞核內NF-κB p65 水平顯著升高（p<0.05），CE 組IκBα 磷酸化及細胞核內NF-κB p65 水平呈下降趨勢，但差異無統計學意義；與HC 組相比，HE 組IκBα 磷酸化及細胞核內NF-κB p65 水平顯著降低（p<0.01）。

2.6 實驗大鼠睪丸組織超微組織結構變化

從實驗組大鼠睪丸組織透射電鏡圖中觀察發現， 與NC組相比較，HC 組線粒體出現腫脹， 線粒體內嵴紊亂和密度降低，內質網表現出應激跡象，自噬小泡的增多，CE 組出現大量線粒體，組織良好，嵴結構正常，內質網發育良好，看起來正常， 核糖體附著在膜上， 自噬小泡在睪丸組織中以低水平存在； 與HC 組相比較，HE 組出現很多管狀嵴的線粒體以及數量不等的脂滴形成，線粒體內脊曲折程度差異較小，內質網中未折疊蛋白數量減少，觀察到有大量自噬小泡的形成。

2.7 睪丸組織NF-κB、自噬和炎癥之間的相關性

熱圖中每個小格子都代表了兩個樣本之間的相關性，采用顏色編碼來表示不同樣本之間的相關性程度， 小格子的顏色深淺則代表了相關性的強度，橘色代表正相關，藍色代表負相關。 通過熱圖相關性分析，發現NF-κB 與p62、LC3-II/LC3-I、IL-6 和TNF-α 均顯著相關（p<0.05），其中NF-κB 與p62、IL-6 和TNF-α 呈正相關，與LC3-II/LC3-I 呈負相關；IL-6 與p62 和TNF-α 呈正相關， 與LC3-II/LC3-I 呈負相關；TNF-α與p62 呈正相關，與LC3-II/LC3-I 呈負相關。

3 討論

3.1 肥胖對脂代謝及炎癥的影響

在脂代謝方面， 與正常對照組相比，6 周的高脂飲食誘導使大鼠體重、Lee's 指數、 食欲和食物攝入量增加，TG、TC 和LDL 顯著升高，脂質代謝發生變化，導致血液中膽固醇和甘油三酯水平呈升高趨勢，與前人研究結果相似［13-14］。 主要原因是肥胖破壞了脂質代謝環境， 體重和攝食量的增加容易造成脂肪組織質量增加和脂肪細胞肥大，從而導致脂質穩態失衡，引起血脂異常。 研究發現，大鼠睪丸組織中促炎因子TNF-α 和IL-6 均呈升高趨勢， 同時在透射電鏡中觀察到肥胖大鼠睪丸組織線粒體異常，內質網有應激跡象，一方面可能是睪丸組織中增大的脂肪引發了慢性低度炎癥，涉及游離脂肪酸激活toll樣受體4（TLR4）信號傳導［15］，從而刺激促炎細胞因子和趨化因子的產生， 促炎細胞因子和趨化因子可以通過刺激活性氧（ROS） 的異常升高和促進巨噬細胞M1 型表達等免疫細胞向睪丸組織的滲透，在睪丸組織中誘導氧化應激和炎癥［16-17］。 另一方面， 高脂飲食致睪丸組織脂肪的大量的堆積使免疫細胞產生促炎因子，從而產生睪丸炎癥，由于內質網應激可導致活性氧的產生和促炎細胞因子的釋放，從而損傷線粒體［18］。 也可能是肥胖導致內質網應激引起的線粒體功能障礙［19］。 具體的作用機制還有待補充和完善， 這些影響不僅導致了脂代謝功能紊亂還可能會使其他與肥胖有關的并發癥的風險增加。

3.2 脂代謝異常及自噬與炎癥的關系

脂質代謝異常與多種疾病有關， 包括肥胖、2 型糖尿病和非酒精性脂肪肝（NAFLD）［20-21］。 血脂異常是脂質代謝異常的常見表現，其特征是甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）水平升高，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平降低，與本研究結果一致。 自噬在調節脂質代謝中起著關鍵作用，因為它可以降解脂滴并有助于能量的產生， 是維持細胞穩態和能量平衡的關鍵過程， 其過程涉及將脂質等細胞成分螯合到自噬體中，自噬體隨后與溶酶體融合以降解貨物，脂質代謝失調會導致脂質積聚，從而破壞自噬并導致脂滴的形成。 脂滴可以激活NLRP3 炎癥小體并促進促炎細胞因子的釋放。本研究發現，高脂誘導的肥胖大鼠TNF-α 和IL-6 均升高，同時P62mRNA 含量和LC3-ImRNA 水平增加，LC3-IImRNA 含量降低， 提示營養性肥胖下，大量的促炎因子浸潤使得睪丸處于炎癥狀態，可能是自噬水平降低引起的， 說明炎癥與自噬可能存在密切聯系。 相比之下，增強自噬可能預防睪丸炎癥引起的雄性功能障礙，因為自噬可以選擇性地去除受損的細胞器，如線粒體，線粒體可以產生并激活炎癥小體， 從而調節細胞因子的產生和炎癥［22］。 自噬除了可以調節免疫細胞和主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）的表達外［23-24］，還可以通過多種機制調節睪丸組織的炎癥， 主要機制之一是調節細胞因子的產生和釋放［25］。 此外，炎癥可以通過改變關鍵自噬調節因子的活性來抑制自噬［26］。 脂質代謝異常、炎癥和自噬之間的關系是一個復雜而多方面的現象。 脂質代謝失調會破壞自噬，導致脂質積聚和炎癥的促進。 相反，炎癥也會抑制自噬，這可能會進一步加劇脂質代謝異常。

3.3 運動對脂代謝異常及機體炎癥的干預作用

8 周的游泳運動干預后發現，在肥胖大鼠中，出現血漿甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇水平降低以及高密度脂蛋白水平提高與運動有關，提示通過運動改善了脂質代謝，本研究的結果證實運動不僅僅是單純的改善肥胖引起的體重增加，更重要的是改善了因肥胖帶來的代謝功能減退， 增加了肥胖者的代謝健康，相較于減肥藥物和節食，因運動改善的肥胖在體重反彈后仍減少了肥胖為機體帶來的相關危害［27］。 此外，運動還被發現具有抗炎作用， 這可能有助于其對脂質代謝的有益作用，肥胖的形成機制是由慢性炎癥引起的［28］，運動被證明可以通過多種機制減少慢性炎癥［29］。 本研究發現經過8 周的游泳運動，2 組運動組相較于2 組對照組， 抗炎細胞因子IL-10的表達都呈增加趨勢， 同時促炎細胞因子TNF-α 和IL-6 的表達呈降低趨勢。 因此，運動干預可能是預防和治療代謝紊亂和炎癥的一種很有前途的策略。

3.4 運動對高脂誘導肥胖大鼠睪丸組織自噬的影響

肥胖對男性生殖健康影響的一個潛在機制是睪丸組織自噬受損［30-31］。Samaneh 等人通過對大鼠進行為期4 周的不同強度游泳運動發現， 不同強度均可增加睪丸組織中自噬相關蛋白Atg7、LC3、Beclin-1 和p62 的表達，但中等強度游泳介導的自噬最可能導致大量生殖細胞消除和支持細胞的吞噬［32］。 本研究通過8 周中等強度游泳運動干預發現， 除了體重、Lee's指數、TG、TC 和LDL 水平均降低外，P62mRNA 和LC3-ImRNA 水平也均降低，LC3-IImRNA 含量升高， 同時IL-6 和TNF-α 水平均降低。 原因主要是在自噬發生過程中，LC3-I 需要不斷脂化形成LC3-II，促進自噬體膜的形成，因此將LC3-II和LC3-I 之比作為判斷自噬活性的標志［33］。 同時轉運蛋白P62與LC3-I 在自噬的過程中被降解。 提示運動會激活肥胖大鼠睪丸組織的自噬，從而改善睪丸功能，減少睪丸炎癥。 運動對自噬的激活可能是運動對肥胖患者睪丸功能障礙和炎癥保護作用的潛在機制，還需要進一步的研究來證實這些發現，并確定激活肥胖睪丸組織自噬的最佳運動方案。 同時，不同負荷對睪丸組織的產生影響還需要更深入的研究。

3.5 運動調控NF-κB信號通路的作用機制

在某些病理條件下，如肥胖、感染、損傷等，NF-κB 通路可能會失調，并導致睪丸炎癥的發展［34-35］。 本研究發現，高脂誘導的大鼠除了NF-κB、TNF-α 和IL-6 顯著升高外， 還顯著的增加了睪丸組織中NF-κB p65 含量和Iκb 磷酸化水平。 提示在肥胖中， 脂肪組織質量增加和脂肪細胞功能障礙會導致慢性低度炎癥，這可能是激活了NF-κB 信號通路。 推測NF-κB信號通路上游TNF-α 等炎癥因子與細胞膜表面的TNF 受體結合之后，受體就發生了構象的改變，胞內段就能跟下游的分子發生相互作用，招募一些蛋白，從而把信號傳遞給Ikk 激酶（Ikk kinase），盡管上游的信號來源有很多條，但是最終這些信號都會匯集到Ikk，作為激酶的Ikk，它的作用是磷酸化，導致其從三聚體當中解離出來，這樣NF-κB 的二聚體（p65/p50 或p65/p65）就能暴露出核定位序列，被迅速地從細胞質轉入到細胞核內，與核內DNA 上面的特異性序列相結合，促進相關基因的轉錄，從而激活NF-κB。研究表明，被激活的NF-κB 信號通路損傷睪丸細胞，誘導睪酮合成障礙、睪丸形態改變、精子質量降低和睪丸炎癥等，最終導致性行為減少［36-37］。 在炎癥過程中，NF-κB 信號通路還通過調節細胞凋亡和細胞存活等過程，調節炎癥的進程。 例如，NF-κB 信號通路可以抑制細胞凋亡通路，通過表達抗凋亡蛋白，如Bcl-2 和Bax，從而促進炎癥過程中的細胞存活［38］。 此外，NF-κB 信號通路還可以誘導自身的負調控，通過表達IκBα 等分子，調節NF-κB 的激活程度［39］。 基于此我們發現抑制NF-κB 信號通路是可能有效治療肥胖致睪丸炎癥的策略， 為此我們通過8 周無負重游泳運動逆轉了肥胖大鼠睪丸組織中NF-κB 的激活與失調，NF-κB p65 含量和Iκb 磷酸化水平降低， 明顯降低了TNF-α 和IL-6促炎因子。 這與Yi 等人研究的結論一致，他們通過不同負荷的運動對肥胖小鼠進行為期8 周的游泳干預， 發現只有中等負荷運動能有效緩解肥胖引起的氧化應激，下調NF-κB 的表達和促炎細胞因子，并逆轉睪酮合成酶mRNA 和蛋白表達、血清睪酮水平和精子質量的下降［40］。

4 結論

經深入的機制研究發現， 長期堅持規律的中等強度游泳可以改善肥胖大鼠的體重和脂肪代謝， 并減少睪丸組織的炎癥，提升自噬活性，這種改善可能與游泳對NF-κB 信號通路的調節有關。 具體而言，游泳可以抑制NF-κB 信號通路的激活、啟動睪丸組織自噬程序來減輕營養性肥胖誘導的炎癥。