IGF-1過表達的骨髓間充質干細胞保護軟骨細胞免受IL-1β誘導的損傷

向文遠, 易 林, 鄧迎杰, 方 銳

(1新疆醫科大學第四臨床醫學院, 烏魯木齊 830054; 2新疆醫科大學附屬中醫醫院骨二科, 烏魯木齊 830099)

骨關節炎(Osteoarthritis,OA)是臨床最常見的骨關節退行性疾病,以關節軟骨破壞、變性以及骨質增生為主要表現,其中關節軟骨缺乏血液供應且易受損,一旦損傷就難以自身修復[1]。因此,關節軟骨修復是國內外研究的熱點[2]。

骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)作為目前組織工程學中最具潛力的種子細胞[3],具有良好組織分化及免疫調節能力,可以調節軟骨受損部位局部微環境,抑制軟骨細胞凋亡、變性,進而促進組織修復[4-5]。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是軟骨自穩態調節以及其發育中重要的生長因子之一,它能促進軟骨細胞增殖分裂[6]。同時,IGF-1是BMSC的重要旁分泌生長因子[7],有研究表明,骨髓間充質干細胞中IGF-1的過度表達導致脊髓損傷中細胞存活、免疫調節和功能改善的增加[8]。研究顯示,外源基因經慢病毒介導后易于導入間充質干細胞,并獲得高效、長期表達[9]。因此,本研究采用IGF-1慢病毒載體轉染BMSCs抑制體外白細胞介素-1β(IL-1β)誘導條件下軟骨細胞的凋亡,提高軟骨細胞增殖活性,探討其中可能的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑大鼠骨髓間充質干細胞(貨號:CP-R131)、軟骨細胞(貨號:CP-R087)購于武漢普諾賽生命科技有限公司;10%胎牛血清完全培養基(Procell公司);0.25%胰蛋白酶溶液(武漢普諾賽生命科技有限公司);PE(美國Invitrogen公司);5 ng/mL IL-1β(美國RD公司);實時熒光定量PCR儀(美國Invitrogen公司);CCK-8試劑盒(美國MCE公司);Lenti-IGF-1-EGFP慢病毒(上海吉凱基因化學技術有限公司),IGF-1、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、細胞色素C(Cytc)抗體(Affinity公司);AnnexinV-APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司);倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 BMSCs培養鑒定和轉染將原代大鼠BMSCs復蘇后接種于25 cm2細胞培養皿中,加入3 mL含90% α-MEM+10%胎牛血清,置于5%CO2,37℃培養箱中培養。觀察并記錄細胞形態和生長情況,生長至85%融合時進行傳代培養。使用流式抗體染色收集的BMSCs,并經流式細胞儀檢測其表面抗原CD90、CD34的表達,以鑒定BMSCs。

取P3代BMSCs接種6孔板,細胞密度生長至60%,加入不同轉染復數(Multiplicity of infection,MOI)的慢病毒,包括包裝好的Lenti-IGF-1-EGFP慢病毒、空白Lenti-EGFP慢病毒,混勻培養并更換新鮮的10%胎牛血清的培養基,繼續培養,72 h后在熒光顯微鏡下觀察結果。當MOI=40時,細胞轉染效率達到97%,設為最佳感染復數值。取最佳轉染復數值的慢病毒轉染BMSCs,接種于6孔板,孵育24 h后,分為UC-BMSCs組、UC-BMSCs-vector組和UC-BMSCs-IGF-1組,細胞計數后按照3×105個/mL接種于12孔培養板中,實時定量PCR檢測細胞中IGF-1基因的表達。在95℃2 min,95℃5 s,62℃15 s,39個循環,使用Real-timePCR儀進行檢測。引物序列詳見表1。

表1 熒光定量PCR檢測引物序列

1.3 軟骨細胞的培養使用含10%胎牛血清的完全培養基懸浮細胞,接種到25 cm2細胞培養皿中,輕輕吹打混勻,37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養。

1.4 軟骨細胞共培養分組處理取大鼠軟骨細胞調整細胞濃度為1×104/孔,接種于transwell24孔板的外室中,分為正常對照組、IL-1β組、IL-1β+BMSCs組、IL-1β+BMSCs-vector組、IL-1β+IGF-1-BMSCs組。正常對照組常規培養,其余組使用5 ng/mL IL-1β干預軟骨細胞,分別加入IGF-1慢病毒轉染的BMSCs、空載慢病毒轉染BMSCs、未轉染的BMSCs,于體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基,37℃、5%CO2培養箱培養24 h。

1.5 CCK-8檢測細胞增殖在干預24 h后,去除外室原有培養基,每孔加入500 μL新鮮培養基與50 μLCCK-8,37℃培養2 h后,酶標儀測定每孔450 nm處的吸光度值(OD),計算細胞增殖水平。

1.6 Tunel法檢測軟骨細胞凋亡軟骨細胞接種至載玻片,4%多聚甲醛室溫固定。爬片上滴加20 μg/mL的Proteinase K溶液。去離子水溶液潤洗爬片,去掉多余液體。爬片滴加Equilibration Buffer,室溫孵育15 min。冰上解凍BrightRed Labeling Mix。將載玻片置于濕盒內,在37℃孵育1 h。將濕盒用鋁箔紙包裹以避光。滴加DAPI避光孵育5 min,對標本進行染核。用含抗熒光淬滅劑封片,在熒光顯微鏡下觀察采集圖像,每組選取3個視野進行拍照。熒光顯微鏡下組織切片上凋亡的細胞呈紅色熒光,細胞核呈藍色熒光。

1.7 Western blot法檢測軟骨細胞凋亡相關蛋白蛋白裂解液裂解獲得各組蛋白樣品,蛋白定量后將蛋白轉到PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h。PVDF膜分別浸于Caspase-3、Cytc、Bax、Bcl-2抗體稀釋液,4℃,孵育12～14 h。TBST清洗PVDF膜4次,加入二抗,PVDF膜浸于HRP標記二抗稀釋液,室溫,孵育1.5 h。ECL工作液孵育PVDF膜,室溫,5 min。X光片顯影,Bandscan軟件分析條帶灰度值。

1.8 ELISA法檢測細胞提取液中炎癥因子收集軟骨細胞,PBS重懸并反復凍融后,將提取液于1 500 r/min離心10 min,取上清使用ELISA試劑盒檢測其中IL-1β、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達水平。

2 結果

2.1 大鼠BMSCs的培養與表型鑒定大鼠BMSCs接種48 h換液可見少數細胞貼壁,成團塊狀散在分布。P3代成熟BMSCs均勻規律分布,細胞成群,間隙變小,體積較大成梭狀,可見細胞核,基本鋪滿瓶底,見圖1。流式細胞儀檢測結果顯示,大鼠骨髓間充質干細胞高表達CD90(陽性率為97.5%)、CD34(陽性率為0.04%),符合BMSCs表型要求,見圖2。

注: A, P0代BMSCs; B, P3代BMSCs。

注: A, BMSCs表面抗原CD90表達; B, BMSCs表面抗原CD34表達。

2.2 大鼠BMSCs中IGF-1的蛋白和mRNA表達水平通過Western blot和qRT-PCR分別檢測各組大鼠BMSCs的IGF-1基因和蛋白表達水平,結果顯示:UC-BMSCs-IGF-1組、UC-BMSCs組和UC-BMSCs-vector組IGF-1基因表達差異有統計學意義(P<0.05);UC-BMSCs組與UC-BMSCs-vector組的IGF-1基因表達水平差異無統計學意義,見圖3。

注: A-B, 各組BMSCs中IGF-1蛋白表達情況; C, 各組BMSCs中IGF-1的mRNA表達情況。 與UC-BMSCs組相比, aP<0.05; 與UC-BMSCs-vector組相比, bP<0.05。

2.3 BMSCs對IL-1β誘導的軟骨細胞增殖與凋亡的影響與正常對照組相比,IL-1β組增殖活性顯著降低。與IL-1β組相比,IL-1β+BMSCs組、IL-1β+BMSCs-vector組、IL-1β+IGF-1-BMSCs組細胞增殖活性顯著增加(P<0.05),其中IL-1β+IGF-1-BMSCs組軟骨細胞的增殖速度最快,見圖4。

圖4 CCK-8檢測各組軟骨細胞增殖率

根據Tunel檢測結果可知:與正常對照組相比,IL-1β組凋亡率顯著升高(P<0.05);相比IL-1β組,IL-1β+BMSCs組、IL-1β+BMSCs-vector組、IL-1β+IGF-1-BMSCs組軟骨細胞凋亡率顯著下降(P<0.05),見圖5。

注: A, 各組Tunel法檢測的熒光顯微鏡圖像; B, 各組Tunel法檢測的凋亡率。與正常對照組相比, *P<0.05; 與IL-1β組相比, #P<0.05; 與IL-1β+BMSCs組相比, $P<0.05; 與IL-1β+BMSCs-vector組相比, &P<0.05。

2.4 各組軟骨細胞凋亡相關蛋白的表達與正常對照組相比,IL-1β組抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低,凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達升高(P<0.05)。與IL-1β組相比,IL-1β+BMSCs組、IL-1β+BMSCs-vector組和IL-1β+IGF-1-BMSCs組Bax、Caspase-3、Cytc蛋白表達降低,Bcl-2蛋白表達升高(P<0.05),其中IL-1β+IGF-1-BMSCs組對軟骨細胞存活具有更強的保護作用(P<0.05),見圖6。

注: A, 各組Bax蛋白的表達; B, 各組Bcl-2蛋白的表達; C, 各組Caspase-3蛋白的表達; D, 各組Cytc蛋白的表達; E, 各組軟骨細胞凋亡相關蛋白的表達(1-5分別為正常對照組、IL-1β組、IL-1β+BMSCs組、IL-1β+BMSCs-vector組、IL-1β+IGF-1-BMSCs組。 與正常對照組相比, *P<0.05; 與IL-1β組相比, #P<0.05; 與IL-1β+BMSCs組相比, $P<0.05; 與IL-1β+BMSCs-vector組相比, &P<0.05)。

2.5 各組細胞炎癥因子的濃度變化比較與正常對照組相比,IL-1β組提取液中TNF-α、IL-6、IL-1β濃度均顯著升高(P<0.05)。與IL-1β組相比,IL-1β+BMSCs組、IL-1β+BMSCs-vector組、IL-1β+IGF-1-BMSCs組中的TNF-α、IL-6、IL-1β濃度均顯著降低(P<0.05)。與IL-1β+BMSCs組相比,IL-1β+IGF-1-BMSCs組TNF-α、IL-6、IL-1β濃度降低明顯(P<0.05)。與IL-1β+BMSCs-vector組相比,IL-1β+IGF-1-BMSCs組TNF-α、IL-6、IL-1β濃度顯著降低(P<0.05),見表2。

表2 各組細胞間炎癥因子濃度變化比較

3 討論

軟骨損傷是多種骨關節炎的關鍵特征[10],軟骨細胞是軟骨中唯一存在的細胞類型,軟骨細胞的凋亡增強以及細胞合成代謝減少均會破壞軟骨基質的完整性,導致骨關節病變[11],臨床實踐中缺乏有效的治療方法逆轉軟骨損傷和阻止OA的進展。近年來,BMSCs成為軟骨修復領域研究熱點[12],大量體內外研究證實BMSCs可以定向歸巢至組織損傷位置、分化成不同的細胞種類并分泌多種細胞修復因子,參與免疫反應,抑制機體炎癥反應[13-14]。已有研究發現BMSCs改善膝骨關節炎患者的軟骨損傷,減少滑膜炎癥,且不良反應發生率低[15],其機體免疫調節和再生能力能夠改善OA中關節軟骨合成代謝和分解代謝的平衡。重組基因是在再生醫學中實現BMSCs潛力的有效策略[16]。IGF-1是一種促生長的內分泌激素[17],對軟骨具有合成代謝和軟骨保護特性,無論內源或外源性IGF-1,都可以在細胞周期進程中發揮著重要作用,進而促進軟骨細胞的細胞活性和細胞增殖分化[18-19],而低水平的內源性分泌IGF-1不足以有效再生[20]。本研究通過慢病毒轉染技術成功地構建IGF-1過表達的BMSCs。慢病毒轉染法作為一種基于干細胞的治療策略而興起,有望成為治療OA的有效途徑。

骨關節炎中,ECM降解產物會激活關節軟骨細胞表面的機械感受器、細胞因子受體和促炎細胞因子,如TNF-α、IL-1β、IL-6[21]。其中IL-1β是造成軟骨破壞的重要炎癥因子之一,可用于體外誘導骨關節炎細胞模型,軟骨細胞經IL-1β干預后,其增殖活性顯著降低,細胞提取液中炎癥因子IL-6和TNF-α水平顯著升高[22-23]。IGF-1對外界刺激誘導的細胞損傷具有保護作用,Lin等[24]的研究顯示,IGF-1在缺氧條件下,降低心肌細胞凋亡,提高細胞存活率,有效治療急性心肌梗死大鼠。Al-Zikri等[25]的研究報道稱,IGF通過下調miR-22-3p增強BMSCs衍生的神經祖細胞(NPCs)的細胞增殖和存活,治療脊髓損傷。本研究通過5 ng/mL IL-1β干預正常軟骨細胞構建骨關節炎細胞模型,進一步采用IGF-1過表達的BMSCs與IL-1β誘導的軟骨細胞共培養,發現IGF-1過表達的BMSCs可提高IL-1β誘導的軟骨細胞增殖活性,降低細胞提取液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平及細胞凋亡水平,下調軟骨細胞中凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Cytc的表達,上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,說明IGF-1過表達的BMSCs對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷具有保護作用,可能也具有治療骨關節炎的潛能。

本研究中,應用慢病毒轉染法獲得IGF-1過表達的BMSCs。IGF-1-BMSCs抑制IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡,同時降低炎性因子水平,抑制炎癥反應,有效的延緩了骨關節炎的進展。