基于microRNA表達(dá)譜變化探討“秩邊透水道”針法治療對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥患者的療效

馬文娟, 蘇 琦, 陳 靜, 宣婉麗

(1西北婦女兒童醫(yī)院藥劑科, 西安 710061, 2西安醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科, 西安 710021)

子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis,EMS)是一種女性常見婦科疾病,以子宮內(nèi)膜生長于宮腔以外部位為特征[1]。25～45歲為EMS高發(fā)人群,輕者可引起痛經(jīng)、月經(jīng)失調(diào)、慢性盆腔痛等,病情嚴(yán)重者可影響其生育功能,導(dǎo)致不孕,進(jìn)而影響生活質(zhì)量[2]。藥物、手術(shù)為EMS西醫(yī)治療的常見手段,但存在易復(fù)發(fā)、副作用多、費(fèi)用高等缺陷[3]。EMS屬于中醫(yī)“癥瘕”、“痛經(jīng)”范疇,瘀血為其基本病理因素,沖任二脈遭瘀血阻滯,氣血失于暢達(dá),長年累積而發(fā)為EMS[4]。近年來中醫(yī)藥因其效果顯著在EMS治療中受到高度關(guān)注,其中針灸療法被廣泛認(rèn)可[5]。“秩邊透水道”針法作為芒針療法中的獨(dú)特針刺手段之一,根據(jù)特定操作手法從秩邊穴透向水道穴深刺,能夠緩解疼痛,改善子宮血液微循環(huán),并在EMS動(dòng)物模型中已顯示出良好療效[6]。微小核糖核酸(microRNA,miR)為小片段的非編碼類RNA,在EMS子宮內(nèi)膜組織中呈異常表達(dá),與EMS發(fā)生、發(fā)展及其引起的不孕等關(guān)系密切[7]。本研究選取EMS患者為研究對(duì)象,在西醫(yī)治療基礎(chǔ)上采用“秩邊透水道”針法治療,觀察治療前后視覺模擬量表(Visual simulation scale,VAS)評(píng)分、性激素水平、血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)等指標(biāo)變化探討其療效,并從microRNA表達(dá)譜變化角度探索其治療機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料經(jīng)西北婦女兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),選取2019年10月至2022年10月西北婦女兒童醫(yī)院收治的133例EMS患者,按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(n=66)與觀察組(n=67)。西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn):西醫(yī)診斷符合《婦產(chǎn)科學(xué)》[8],包括臨床診斷、B超診斷、腹腔鏡診斷。中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn):中醫(yī)診斷符合《實(shí)用中醫(yī)婦科學(xué)》[9],辨證為氣滯血瘀型:漸進(jìn)性痛經(jīng),經(jīng)前或經(jīng)期少腹脹痛或刺痛,乳房脹痛,經(jīng)色暗、伴黑色血塊且塊下痛減,腹內(nèi)有積塊且按之堅(jiān)實(shí)不移,患者舌苔暗紫或可見瘀點(diǎn),脈弦澀。納入標(biāo)準(zhǔn):符合EMS診斷標(biāo)準(zhǔn)[8-9];無凝血系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤及精神障礙;年齡25～45歲;病歷資料完整;受試者依從性、配合度良好;自愿參加研究并簽訂書面同意。排除標(biāo)準(zhǔn):心肝腎腦肺功能障礙;合并子宮肌瘤;全身性免疫系統(tǒng)疾病;近90 d應(yīng)用過激素類藥; 妊娠、哺乳期婦女。剔除標(biāo)準(zhǔn):不符合納排標(biāo)準(zhǔn)而誤納入本次研究者;發(fā)生嚴(yán)重不良事件、并發(fā)癥和特殊生理變化,不宜繼續(xù)接受治療者;依從性差,不能堅(jiān)持治療者;入組期間主動(dòng)退出試驗(yàn)者。研究實(shí)行患者盲法(接受何種治療方法患者自己不知道,僅針刺操作者知曉),由不清楚分組情況的專職評(píng)價(jià)者對(duì)臨床療效和各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià);由專職統(tǒng)計(jì)人員實(shí)施盲法統(tǒng)計(jì)分析,以保證結(jié)果的真實(shí)可靠性。

1.2 方法

1.2.1 治療方案 對(duì)照組患者于月經(jīng)來潮第1 d口服米非司酮片(規(guī)格25 mg×1片,上海新華聯(lián)制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字 H20000629),1次/d,25 mg/次,連續(xù)治療3個(gè)月。觀察組在對(duì)照組基礎(chǔ)上應(yīng)用“秩邊透水道”針法治療,主穴為秩邊透水道,配穴為膈俞、太沖、血海、氣海、三陰交。操作如下:取俯臥位,皮膚常規(guī)消毒,將芒針(0.25 mm×125 mm)從髂后上棘內(nèi)緣與患者股骨大轉(zhuǎn)子內(nèi)緣連線的下3/5、上2/5交界處進(jìn)針,而后由秩邊穴透向水道穴深刺,令針感達(dá)至人體小腹部為度,捻轉(zhuǎn)法60 s,留針0.5 h。其余穴位常規(guī)針刺,局部有酸脹感為宜,留針0.5 h,其間再施行平補(bǔ)平瀉手法2次。1次/d,連續(xù)治療3個(gè)月。

1.2.2 觀察指標(biāo)

1.2.2.1 臨床療效 治療3個(gè)月后,參考《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[10]評(píng)價(jià)其療效。痊愈:盆腔包塊、臨床癥狀完全消失;顯效:盆腔包塊縮小明顯,癥狀基本消失;有效:盆腔包塊縮小不明顯,癥狀明顯減輕;無效:盆腔包塊增大,癥狀未好轉(zhuǎn)甚至惡化。總有效為痊愈+顯效+有效。

1.2.2.2 VAS評(píng)分 治療前和治療1、2、3個(gè)月后,通過VAS量表評(píng)估患者痛經(jīng)程度,0分、<3分、4～6分、7～10分依次表示無痛、能忍受的輕微疼痛、影響睡眠且尚能忍受的疼痛、難以忍受的強(qiáng)烈疼痛[11]。

1.2.2.3 血清FSH、E2、LH、EMAb、CA125水平測定 治療前和治療3個(gè)月后,收集空腹外周靜脈血5 mL,離心(3 500 r/min、15 min),收集血清,血清樣本-20℃保存?zhèn)錅y。利用ELISA法、賽默飛K3型酶標(biāo)儀(深圳市南方明源光電儀器有限公司)測定血清卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)、雌二醇(Estradiol,E2)、黃體生成素(Luteinizing hormone,LH)、抗子宮內(nèi)膜抗體(Anti endometrial antibody,EMAb)、癌胚抗原125(Carcinoembryonic antigen 125,CAl25)水平,試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司、上海烜雅生物科技有限公司、上海鈺博生物科技有限公司、上海廣銳生物科技有限公司、上海信裕生物科技有限公司。

1.2.2.4 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo) 治療前和治療3個(gè)月后,PF-522型彩色多普勒超聲儀(江蘇大為醫(yī)療有限公司)測定阻力指數(shù)(resistance index,RI)以及搏動(dòng)指數(shù)(pulse index,PI)。

1.2.2.5 外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-141-3p、miR-17-5p、miR-145表達(dá)水平 治療前和治療3個(gè)月后進(jìn)行測定。分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,應(yīng)用Trizol試劑盒(北京凱詩源生物科技有限公司)提取細(xì)胞總RNA,Thermo超微量紫外分光光度計(jì)(濟(jì)南愛來寶儀器設(shè)備有限公司)測RNA濃度、純度,Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海梵態(tài)生物科技有限公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過ABI7500定量PCR儀(上海實(shí)維實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司)檢測,反應(yīng)體系(20 μL):cDNA 1 μL、2×SYBR Green Mix10 μL、去離子水7.4 μL、上下游引物10 μmol/L分別0.8 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖電泳分離,以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-141-3p、miR-17-5p、miR-145相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下:miR-141-3p上游5′-CTACCCTGCGGAGATCAC-3′及下游5′-TAGGACAGCCAGGCCAGCAACA-3′;miR-17-5p上游5′-TCACCCTGAGATGGGAGC-3′及下游5′-AGCTCTTCCTCCTCCACAT-3′;miR-145上游5′ GCCGCAAAGTGCTTACAGTG 3′及下游5′ TGCAGGGTCCGAGGTAT 3′;內(nèi)參U6上游5′-TTGCCGACAGGATGCAGAA-3′及下游5′-GCCGA-TCCACACGGAGTACT-3′。

1.2.2.6 不良反應(yīng) 包括呼吸、脈搏、體溫、血壓等生命體征觀察,血常規(guī)、尿常規(guī)、便常規(guī)檢查,肝、腎功能異常。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較對(duì)照組2例依從性差,未按醫(yī)囑、治療方案執(zhí)行本研究,觀察組有3例受到疫情影響而要求自行退出試驗(yàn),最終共128例完成研究。兩組患者一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

2.2 兩組患者臨床療效比較對(duì)照組中痊愈8例、顯效19例、有效24例、無效13例,觀察組中痊愈14例、顯效26例、有效20例、無效4例,觀察組臨床療效總有效率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者臨床療效比較/例(%)

2.3 兩組患者治療前后VAS評(píng)分比較治療前,兩組患者VAS評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);治療1、2、3個(gè)月后,兩組患者VAS評(píng)分均較治療前降低(P<0.05),且觀察組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖1。

圖1 兩組患者治療前后的VAS評(píng)分曲線圖

表3 兩組患者治療前后VAS評(píng)分比較 分)

2.4 兩組患者治療前后性激素水平比較與治療前比較,兩組患者治療3個(gè)月后FSH、E2、EMAb、CA125、PI、RI、miR-145均降低(P<0.05),LH、miR-141-3p、miR-17-5p均升高(P<0.05),且觀察組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 兩組患者治療前后性激素水平比較

2.5 兩組患者治療前后EMAb和CA125水平比較治療前,兩組患者血清EMAb和CA125水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);兩組患者治療3個(gè)月后EMAb和CA125均降低(P<0.05),且觀察組EMAb和CA125與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 兩組患者治療前后EMAb和CA125水平比較

2.6 兩組患者治療前后血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較治療前,兩組患者PI、RI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);治療3個(gè)月后,兩組患者PI、RI均降低(P<0.05),且觀察組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6。

表6 兩組患者治療前后PI、RI比較

2.7 兩組患者治療前后的EMS相關(guān)microRNA表達(dá)水平比較兩組患者治療前外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-141-3p、miR-17-5p、miR-145表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);治療3個(gè)月后,兩組患者治療后miR-141-3p和miR-17-5p表達(dá)水平均升高(P<0.05),miR-145表達(dá)水平降低(P<0.05),且觀察組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表7。

表7 兩組患者治療前后的EMS相關(guān)microRNA表達(dá)水平比較

2.8 兩組患者安全性分析用藥過程中兩組患者呼吸、脈搏、體溫、血壓等生命體征均平穩(wěn),血、尿、便常規(guī)基本正常,均未見嚴(yán)重不良反應(yīng)。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為血瘀是EMS基本病理基礎(chǔ),貫穿EMS發(fā)生和發(fā)展,而血瘀通常與氣滯關(guān)系密切,氣機(jī)受阻,血行不暢,而形成瘀血,瘀血停滯下焦,不通則痛,瘀滯日久而形成癥瘕,瘀血內(nèi)阻沖任胞宮,則難以攝精成孕[12]。針灸屬于中醫(yī)療法中較為常見的一種,能調(diào)暢全身氣機(jī),推動(dòng)氣血運(yùn)行。“秩邊透水道”針法是獨(dú)具特色的中醫(yī)技術(shù)之一,具有疏通經(jīng)絡(luò)、活血化瘀、補(bǔ)益腎氣、改善局部血液循環(huán)、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、緩解疼痛之效。研究顯示,“秩邊透水道”針法治療對(duì)原發(fā)性痛經(jīng)治療效果顯著,可有效改善下腹部陣發(fā)性絞痛癥狀[13-14];“秩邊透水道”針法治療可通過增加大鼠子宮內(nèi)膜組織Beclin-1與LC3水平以改善EMS癥狀[15]。

本研究結(jié)果顯示,觀察組臨床療效總有效率顯著高于對(duì)照組,治療1、2、3個(gè)月后VAS評(píng)分顯著低于對(duì)照組,提示“秩邊透水道”針法治療子宮內(nèi)膜異位癥的臨床療效較佳。EMS是一種激素依賴性疾病,患者FSH、E2、LH常處于異常狀態(tài),進(jìn)一步加重了EMS病情[16]。本研究顯示,兩組患者治療后FSH、E2降低,LH升高,且觀察組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示“秩邊透水道”針法治療有助于調(diào)節(jié)患者性激素水平。EMAb是子宮內(nèi)膜靶向抗體,其水平高低可反映EMS疾病活動(dòng)度,有助于判斷EMS臨床轉(zhuǎn)歸;CA125是一種膜抗原,通常分布于子宮內(nèi)膜、腹膜、正常生殖道,其在EMS中表達(dá)水平明顯上調(diào),并與EMS病情程度呈正相關(guān),是診斷EMS的重要指標(biāo)[17]。本研究顯示,兩組患者治療后EMAb和CA125均降低,且觀察組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示“秩邊透水道”針法治療可有效降低患者外周血EMAb和CA125水平。EMS發(fā)生后,患者子宮動(dòng)脈血流灌注受阻,其血流速度變緩,PI、RI增高[18]。本研究顯示,兩組患者治療后PI、RI降低,且觀察組降低更明顯。分析原因如下:秩邊穴是“足太陽膀胱經(jīng)”之重要穴位,針刺該穴可清利下焦、調(diào)理氣血、疏通經(jīng)絡(luò);水道穴為足陽明胃經(jīng)腧穴,刺之可起到行氣活血、利水調(diào)經(jīng)之效;此外,針刺氣海穴可調(diào)一身元?dú)?氣充則能統(tǒng)攝血液,固攝胞宮;血海穴是脾經(jīng)所生之血聚集地,刺之可起到活血化瘀、引血?dú)w經(jīng)之效;膈俞穴屬足太陽膀胱經(jīng),刺之有寬胸理氣、活血通脈之功;太沖穴屬足厥陰肝經(jīng),有調(diào)和氣血、通絡(luò)止痛之功;三陰交為足三陰之會(huì)穴,是婦科疾病之常用穴位,刺之可發(fā)揮培元固本、調(diào)和沖任、調(diào)理氣血、調(diào)經(jīng)止痛作用。此外,用藥過程中兩組患者均未見嚴(yán)重不良反應(yīng),提示該治療方案安全性較好。

EMS病因復(fù)雜,microRNA調(diào)控為表觀遺傳機(jī)制中的關(guān)鍵組成部分,在轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控中具有重要作用[19]。多項(xiàng)研究已表明,microRNA與EMS病理過程相關(guān),可調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞增生、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)、血管形成、炎癥反應(yīng)等[20-21]。有研究發(fā)現(xiàn),miR-141-3p分子與EMS關(guān)系密切,其在EMS中呈低表達(dá);miR-141-3p可靶向抑制轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)活性,抑制EMS子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞黏附、侵襲,進(jìn)而阻止EMS進(jìn)展[22-23]。有研究顯示,外周血miR-17-5p表達(dá)水平與EMS患者痛經(jīng)程度、r-AFS分期均呈負(fù)相關(guān);與正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞相比,在EMS患者子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中miR-17-5p水平明顯下調(diào),過表達(dá)miR-17-5p可減弱子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖活性,并誘導(dǎo)其凋亡[24-25]。既往報(bào)道提到,EMS子宮內(nèi)膜組織中miR-145表達(dá)上調(diào),miR-145可通過促進(jìn)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞EMT過程,促進(jìn)EMS病情進(jìn)展[26-27]。本研究結(jié)果顯示,EMS患者經(jīng)“秩邊透水道”針法治療+西醫(yī)治療后,其外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-141-3p、miR-17-5p表達(dá)水平明顯升高,miR-145表達(dá)水平明顯下降。

綜上所述,“秩邊透水道”針法治療子宮內(nèi)膜異位癥患者的療效較佳,可有效減緩?fù)唇?jīng)程度,調(diào)節(jié)性激素及EMAb、CA125水平,改善血流動(dòng)力學(xué)狀態(tài),其療效機(jī)制可能與上調(diào)miR-141-3p、miR-17-5p及下調(diào)miR-145表達(dá)水平有關(guān)。但本研究樣本量有限,未進(jìn)行長期隨訪,且未對(duì)炎癥因子及復(fù)發(fā)、妊娠情況等進(jìn)行觀察,今后需進(jìn)一步深入研究。