調肝清心沖劑治療室性早搏分子機制研究

姚繼紅,孫櫻丹,張海燕,王丹妮

(煙臺市煙臺山醫院,山東 煙臺 264008)

室性早搏是一種常見的臨床心律失常,也稱為室性期前收縮,是由于心室內某異位室內節律電脈沖過早導致的心臟去極化,常發生在冠心病和心肌病等器質性心臟病中[1-2]。室性早搏在臨床上的發病率和致殘率較高,輕癥患者僅存在心悸不適,重癥患者則出現心室顫動等,如果不及時治療,患者會誘發心力衰竭等惡性心血管事件,嚴重威脅患者的生命安全[3]。目前,西醫常用抗心律失常藥物,鉀拮抗劑、鈉拮抗劑、β受體拮抗劑和鈣拮抗劑以及射頻消融手術來治療室性早搏,但易出現負性肌力等不良反應[4],整體效果不佳。中醫學中將室性早搏劃分為“心悸”“怔忡”等范疇,目前多數醫家認為其病機為本虛標實[5]。基于此,本研究通過觀察大鼠模型實驗,探討調肝清心沖劑的作用機制,闡明缺血性室性早搏的發病機制并提出針對性的治療;通過觀察大鼠模型實驗,探討調肝清心沖劑灌胃預處理對缺血性心律失常大鼠心肌酶學、心律失常發生率及間隙連接蛋白43(Cx43)表達的影響,探討其治療室性早搏的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:實驗于2016年5月至2017年5月進行。清潔級SD大鼠購自山東省實驗動物中心,由40只6～8周齡的SD大鼠(雌雄各半,體重180～220 g)作為受體。本實驗經煙臺市煙臺山醫院醫學倫理委員會批準(批準號:煙山倫準2023050號)。

1.1.2 實驗藥物:穩心顆粒(規格:9 g/袋,國藥準字Z10950026,廠家:山東步長制藥股份有限公司)。調肝清心沖劑組成:珍珠母、炒棗仁、葛根、赤芍、白芍各30 g,全瓜蔞、石菖蒲各15 g,柴胡、枳殼、郁金、半夏、苦參、炙甘草各10 g,黃連6 g,中藥藥材由北京同仁堂藥店提供,水煎并濃縮,制成沖劑備用。

1.2 實驗方法 分組處理及模型建立:按隨機數字表法將SD大鼠分為假手術組、模型組、穩心顆粒組、調肝清心沖劑治療組四組,每組10只大鼠(雌雄各5只),共40只實驗大鼠。假手術組采用0.9%NaCl溶液等劑量灌胃;模型組采用0.9%NaCl溶液等劑量灌胃;穩心顆粒組采用1 ml/100 g(相當于4.28 g生藥/kg體重)的劑量每天1次灌胃,在手術前7天開始;調肝清心沖劑治療組,1 ml/100 g(相當于4.28 g生藥/kg體重)的劑量每天1次灌胃,在手術前7天開始。模型制備:連續用藥7 d后,對大鼠進行稱重,并通過腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉進行麻醉。將大鼠以俯臥姿勢固定在老鼠床上,并進行氣管切開。將大鼠的四肢皮下連接到BL-420E生物功能實驗系統,并記錄標準的Ⅱ導聯心電圖。通過開胸,在左胸骨第三和第四根肋骨之間擠出心臟,并通過冠狀動脈前降支下的1號絲線將心臟重新定位,收緊絲線5 min,松開5 min,共3次;當心電圖監測中ST段明顯升高時,即認為缺血成功。假手術組大鼠僅開胸,不施行冠脈結扎。

1.3 觀察指標

1.3.1 室性早搏出現的時間和持續時間:在灌注后30 min內通過心電圖監測記錄各組室性早搏出現的時間和持續時間。

1.3.2 室性早搏和室性心動過速的發生頻率:在灌注后30 min內通過心電圖監測記錄室性早搏和室性心動過速的發生頻率。

1.3.3 心律失常評分:采用Mest法[6]評估心律失常評分,竇性心律為0分;室上性心律失常,Ⅰ度房室傳導阻滯為20分;Ⅱ度房室傳導阻滯,室性早搏二聯律、三聯律為40分;多源性室早、陣發室速為60分;心室顫動為80分;死亡為100分。

1.3.4 血清中乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(Creatine kinase,CK)水平、Cx43含量:檢測完心電圖后,從腹主動脈采集5 ml血液,在室溫下儲存8 h,以3000 r/min離心10 min,上清液儲存在-20 ℃的冰箱中,采用速率法測定LDH、CK水平;Western blot法測定大鼠左室心肌組織細胞Cx43的表達:將心室心肌組織從-80 ℃的冰箱中取出,在冰上研磨后加入裂解液,從每組心肌組織中提取總蛋白,用BCA試劑盒定量,確定每組的總蛋白濃度,在12%的SDS-PAGE分離凝膠上電泳后,用5%的脫脂牛奶洗膜2 h,徹底洗凈用兔抗Cx43大鼠一抗(1∶1000,Affinity,美國)孵育過夜;第2天,加入HRP結合的二抗(1∶1000,北京博奧森生物技術有限公司,中國),在室溫下搖晃孵育1 h,然后ECL顯影并使用全自動化學發光成像系統(Tanon-5200上海天能科技有限公司,中國)曝光。用圖像處理軟件Image J分析灰度帶值,用GAPDH(1∶1000,Bioword,美國)作為內部參考計算相對蛋白含量。

2 結 果

2.1 各組大鼠室性早搏出現時間和持續時間比較 與假手術組、模型組、穩心顆粒組比較,調肝清心沖劑治療組的室性早搏出現明顯增加和持續時間明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠室性早搏出現時間和持續時間比較(min)

2.2 各組大鼠室性早搏和室性心動過速發生率比較 調肝清心沖劑治療組的室性早搏和室性心動過速的發生率均低于假手術組、模型組、穩心顆粒組,差異有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠室性早搏和室性心動過速發生率比較[例(%)]

2.3 各組大鼠Mest評分比較 與假手術組、模型組、穩心顆粒組比較,調肝清心沖劑治療組的Mest評分明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05),見表3。

表3 各組大鼠Mest評分比較(分)

2.4 各組大鼠血清LDH、CK水平比較 與假手術組、模型組、穩心顆粒組比較,調肝清心沖劑治療組的血清LDH、CK水平明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05),見表4。

表4 各組大鼠血清LDH、CK水平比較(U/L)

2.5 各組大鼠心肌組織Cx43含量比較 與假手術組、模型組、穩心顆粒組比較,調肝清心沖劑治療組的Cx43含量明顯增高,差異有統計學意義(P<0.05),見表5。

表5 各組大鼠心肌組織Cx43含量比較

3 討 論

研究表明,常規24 h動態心電圖的室性早搏發生率為40%～75%,其發生率隨年齡增長而呈上升趨勢[7-8]。室性早搏臨床常見癥狀有心悸、呼吸困難、暈厥等,它能引起收縮期左心室功能障礙,誘發心室相關的心肌病,對患者的生活質量造成嚴重影響[9-10]。隨著現代生活方式和生活方式的改變,室性早搏的發病率越來越高,如工作壓力增大,過量飲酒、吸煙、食用脂肪和甜食,部分患者常伴有情緒不穩定、焦慮和抑郁,這些都會加重心悸癥狀,形成惡性循環[11]。目前,西醫主要使用抗心律失常藥物來治療室性早搏,但西藥的不良反應和導管消融術的創傷性操作令部分患者難以受益[12]。

近年來,中醫中藥作為治療室性早搏的重要手段,受到了患者的歡迎,現代中醫認為,心悸的主要病理是血液充盈、脈絡不通,治療應以活血為主[13]。而有些學者認為,心悸的主要原因是心脾兩虛,治療應以健脾養心、補氣養血為主[14-15]。本文選用的調肝清心沖劑,方中柴胡、枳殼共為君藥,疏肝理氣為主;郁金、赤芍、白芍、全瓜蔞、半夏、黃連合而為臣藥,清熱燥濕、化痰活血;苦參、石菖蒲、葛根、珍珠母、炒棗仁共為佐藥,寧心安神定悸;炙甘草養陰生津、益氣復脈為使藥,全方主疏肝理氣、寧心安神。本研究結果中,調肝清心沖劑治療組的室性早搏和室性心動過速的發生率以及室性早搏出現和持續時間明顯增高,且Mest評分明顯降低,提示調肝清心沖劑能夠縮短早搏出現時間和持續時間,并減少心率失常的發生個數。本研究使用藥方以疏肝理氣為先,柴胡疏肝解郁,枳殼行氣消脹。李三洋等[16]以疏肝湯加減治療肝郁氣滯型室性早搏,患者服用1月余病愈且無復發;以化痰清熱為助,郁金清心活血,全瓜蔞辛溫化燥;另加以珍珠母、炒棗仁安神定悸。

LDH是與蛋白質結合的酶,在臟器障礙和重癥感染癥中表達顯著上升,水平越高表示病情越嚴重[17]。CK廣泛存在于骨骼肌、心肌及大腦組織中,能夠維持細胞能量的穩態,其水平可以反映潛在疾病過程中的嚴重程度和肌肉失神經的程度[18-20]。本研究結果中,調肝清心沖劑治療組的血清LDH、CK含量與其他組比較明顯降低,Cx43含量明顯增高,提示室性早搏的發病機制可能與降低LDH、CK水平,增加Cx43含量有關。安麗等[21]的研究指出,心肌缺血后再灌注損傷后容易出現再灌注心律失常,心律失常的發生與Cx43表達減少有關。中藥的現代藥理學研究為中藥治療室性早搏提供了理論依據。本研究選用的藥方中,柴胡提取物對中樞神經有明顯的抑制作用[22],黃連抗心律失常,能夠降低心肌自律性[23],白芍提取物具有鎮靜作用[24],全方化痰清熱疏肝理氣,在抗心律失常方面具有較大的優勢。

綜上所述,調肝清心沖劑灌胃能夠降低心肌缺血模型大鼠心律失常的發生率,其機制可能與降低LDH、CK水平,增加Cx43含量有關。