頭針針刺對(duì)血管性癡呆大鼠行為及海馬體膽堿能抗炎通路的影響

李 忍,葉宇旋,周蔚華

(深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院,廣東 深圳 518133)

血管性癡呆(Vascular dementia,VD)是一種認(rèn)知功能障礙性疾病,主要致病原因是腦血管發(fā)生病變,其發(fā)病率僅次于阿爾茲海默癥病的第二大類型癡呆癥,在癡呆患者總?cè)藬?shù)中占比15%～20%,部分發(fā)展中國(guó)家或地區(qū)可達(dá)30%。隨著全球人口老齡化,VD發(fā)病率明顯上升[1]。研究表明VD具有可逆性,但由于病因復(fù)雜,目前尚未清楚其發(fā)病機(jī)制,故臨床仍缺少針對(duì)的特異性治療方法和藥物。炎癥反應(yīng)在VD發(fā)病和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用,可引起膽堿能神經(jīng)元損傷并造成認(rèn)知功能障礙[2]。Custodero等[3]通過一項(xiàng)薈萃分析顯示VD患者腦脊液白介素-6(Interleukin-6,IL-6)水平顯著升高,而IL-6的升高可致VD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加[OR=1.28,95%CI:(1.03～1.59)]。機(jī)體內(nèi)的膽堿能抗炎通路(Cholinergic anti-inflammatory pathway,CAP)可通過神經(jīng)反射抑制全身炎癥反應(yīng),其中乙酰膽堿與巨噬細(xì)胞表面受體結(jié)合可通過NF-κB信號(hào)通路抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)等促炎因子的表達(dá)引起抗炎作用的產(chǎn)生,因此CAP可作為VD治療靶點(diǎn)[4-6]。本研究擬通過建立大鼠VD模型,探討頭針對(duì)大鼠行為的影響并分析CAP及相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取94只健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,來自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào)SCXK(粵)2003-0002,月齡4～5個(gè)月,體重180～220 g。所有大鼠于廣東省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。室溫20～25 ℃,相對(duì)濕度55%,每12小時(shí)晝夜交替。

1.2 主要儀器和試劑 400R低溫離心機(jī)(德國(guó)HeraeuS);722型可見光分光光度計(jì)(上海市第三分析儀器廠);Multiskan MK3型酶標(biāo)儀(芬蘭Thermo Labsystem公司);HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司);Biofuge-28RS型高速冷凍離心機(jī)、DY89-1電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(寧波市新芝科器研究所生產(chǎn));DS-88型托盤天平(武漢市自動(dòng)化工儀表廠生產(chǎn));TGL-16C離心機(jī)(德國(guó)HeraeuS公司);JY3002型電子天平(上海市精密科學(xué)儀器有限公司);DYY-2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一儀器廠);ProTEAN Ⅱ Xi cell電泳槽(美國(guó)Bio-RAD公司);TY-80B水平脫色搖床(上海浦東物理光學(xué)儀器廠);低溫冰箱(南京伯樂電器集團(tuán));S2-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海市亞榮生化儀器廠);MIAS醫(yī)學(xué)圖象分析儀(南京奧康分析儀器有限公司);Motic B5顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司);水合氯醛(上海市五聯(lián)化工廠);亞硝酸鈉(天津市四通化工廠);無水乙醇(鄭州化學(xué)試劑二廠);膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)試劑盒、乙酰膽堿酯酶(AChE)試劑盒、放射免疫沉淀試驗(yàn)(Radioimmunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、考馬斯亮蘭蛋白試劑盒、TNF-α、IL-1β、IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)定量ELISA試劑盒、兔抗鼠核因子-κB(NF-κB)抗體、辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG二抗、硝酸纖維素(Nitrocellulose,NC)膜、PBS、構(gòu)橡酸鹽緩沖液(深圳晶賽生物技術(shù)有限公司)。

1.3 大鼠VD模型建立 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開展水迷宮測(cè)試,然后制備大鼠VD模型采用改良Pulsinelli四血管阻斷法,術(shù)前常規(guī)禁食12 h,禁水4 h,使用10%水合氯醛腹腔注射以麻醉大鼠,劑量0.3 ml/100 g,將麻醉后的大鼠固定于操作板上并呈俯臥位狀態(tài),施術(shù)區(qū)進(jìn)行備皮、殺菌消毒,以第2頸椎棘突為中心在大鼠背側(cè)后頸部作一2 cm垂直切口,按順序切開皮膚以及皮下組織,將頸后部肌群進(jìn)行逐層鈍性分離直至寰椎椎板處,在大鼠翼孔被暴露以后,朝向大鼠頭部方向?qū)⒅睆?.5 mm的電烙針插入翼孔,深度約2 mm,對(duì)大鼠椎動(dòng)脈進(jìn)行間斷性燒灼并維持5～8 s(可重復(fù)灼燒,但一般不超過3次),灼燒至大鼠翼孔周圍的骨質(zhì)逐漸呈現(xiàn)為蒼白色并且無血性液體流出時(shí)停止,之后對(duì)大鼠兩側(cè)頸動(dòng)脈進(jìn)行燒灼以及造成血管腔閉塞,在上述操作完成后為預(yù)防感染應(yīng)使用0.9%氯化鈉溶液沖洗術(shù)區(qū)并滴加慶大霉素進(jìn)行處理,肌肉和皮膚被逐層縫合后在大鼠切口處使用碘伏對(duì)其進(jìn)行消毒處理,對(duì)大鼠進(jìn)行標(biāo)記處理后進(jìn)行分籠飼養(yǎng),對(duì)大鼠術(shù)后的精神狀態(tài)及生命體征變化給予密切監(jiān)測(cè)觀察。在24 h之后再次對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉,使用腹腔注射10%水合氯醛溶液的方法,其劑量為0.3 ml/100 g,將麻醉后的大鼠于操作板上呈仰臥位固定,對(duì)施術(shù)區(qū)進(jìn)行備皮、殺菌消毒,隨后作一個(gè)1.5 cm縱行切口于腹側(cè)頸正中偏下處,將皮膚至頸前肌群使用眼科手術(shù)剪剪開后沿頸正中部肌群與外側(cè)肌群交界處進(jìn)行仔細(xì)分離,分離至頸總動(dòng)脈鞘走行搏動(dòng)處后,將頸總動(dòng)脈周圍筋膜剝離開,使迷走神經(jīng)分離開,3-0號(hào)線游離頸總動(dòng)脈,完成上述操作后對(duì)對(duì)側(cè)使用同法處理,之后使用微型動(dòng)脈夾在游離備用的3-0號(hào)線指引下將雙側(cè)頸總動(dòng)脈可逆性?shī)A閉,松開動(dòng)脈夾在夾閉15 min后。夾閉是否成功標(biāo)準(zhǔn)如下:在夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈30～60 s內(nèi)大鼠出現(xiàn)四肢僵直狀態(tài)并且其呼吸深度加深及速度加快,發(fā)生雙側(cè)眼球顏色變化呈現(xiàn)出灰白色眼球,瞳孔擴(kuò)散變大,眼球顏色可立即恢復(fù)紅色在松開動(dòng)脈夾之后,瞳孔重新縮小呈回縮現(xiàn)象。為預(yù)防感染,在夾閉成功后對(duì)術(shù)區(qū)使用0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行沖洗,并且使用慶大霉素進(jìn)行處理,將其肌肉和皮膚進(jìn)行逐層縫合后,對(duì)切口部位使用碘伏進(jìn)行消毒處理,對(duì)大鼠進(jìn)行標(biāo)記處理后分籠進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.4 分組和給藥 按大鼠體重對(duì)94只大鼠進(jìn)行編號(hào),給予常規(guī)飼養(yǎng)1周后將大鼠隨機(jī)分為正常組12只、假手術(shù)組12只和造模組70只。本研究共造模造模成功48只,成功率為68.57%,其中假手術(shù)組大鼠僅暴露雙側(cè)椎動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈,不行灼燒或夾閉操作。將造模成功的48只VD大鼠于造模第4周隨機(jī)分為模型組、美金剛組、頭針組及聯(lián)合組各12只,各組干預(yù)方法如下。

美金剛組:按體表面積法將鹽酸美金剛臨床用量折算為大鼠用藥劑量。人體表面積按照許文生氏公式計(jì)算:體表面積(m2)=0.0061×身高(cm)+0.0128×體重(kg)-0.1529,其中成人平均體重55 kg,平均身高165 cm。計(jì)算得成人平均體表面積為1.5576 m2,美金剛用量按10 mg/d計(jì)算,即成人用藥量約0.181 mg/kg,按體表面積計(jì)算約為6.420 mg/m2。大鼠體表面積按照Meeh-Rubner氏公式進(jìn)行計(jì)算:體表面積(m2)=K×體重W(g)2/3×10-3,大鼠K=9.1,平均體重200 g。計(jì)算得平均體表面積為0.031 m2,因此大鼠等效用藥劑量為6.420× 0.031/0.2≈1 mg/kg,取10 mg鹽酸美金剛加入50 ml 0.9%氯化鈉溶液中,制成濃度0.2 mg/ml溶液,于每日8:00前對(duì)大鼠進(jìn)行稱重,計(jì)算用藥量并進(jìn)行灌胃。

頭針組:選用28號(hào)1寸毫針,參照大鼠穴位圖譜[9]選取百會(huì)、四神聰進(jìn)行針刺,斜刺入針4 mm,施以捻轉(zhuǎn)手法5 min,留針15 min,再次施以捻轉(zhuǎn)手法5 min后取針,每周針刺6 d,休息1 d。同時(shí)于每日8:00前對(duì)大鼠進(jìn)行稱重,并按照每金剛組中用藥量換算為相應(yīng)體積0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行灌胃。

聯(lián)合組:按照頭針組和美金剛組中針刺及給藥方法進(jìn)行干預(yù)。

正常對(duì)照組、假手術(shù)組和模型組:每日8:00前對(duì)大鼠進(jìn)行稱重,并按照美金剛組中用藥量換算為相應(yīng)體積0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行灌胃。

1.5 行為學(xué)評(píng)價(jià) 分別于造模前、造模4周、治療4周和治療8周進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn),水池高度為40 cm,直徑160 cm,水深30 cm,水溫(23±1)℃,直徑10 cm,高度28 cm的無色透明平臺(tái)。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)包括2個(gè)部分:①定位航行試驗(yàn):將大鼠頭朝池壁放入水池中開始計(jì)時(shí),至四肢完全站上平臺(tái)為止所需時(shí)間為逃避潛伏期,以120 s為限,超過者計(jì)為120 s,定位航行試驗(yàn)共進(jìn)行5 d,前2天為適應(yīng)性階段,計(jì)算第3～5天逃避潛伏期均值,視為最終結(jié)果。②空間探索試驗(yàn):定位航行試驗(yàn)結(jié)束第2天撤掉無色透明平臺(tái),將大鼠從平臺(tái)所在象限放入水中并觀察120 s內(nèi)穿越原平臺(tái)區(qū)域的次數(shù),每只大鼠重復(fù)3次取平均值。

1.6 膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)活性檢測(cè) 干預(yù)8周后將各組大鼠斷頸處死,取出腦組織并分離海馬,取部分海馬組織稱重后按重量與0.9%氯化鈉溶液體積1∶10比例配制冰浴勻漿,震蕩30 min后在4 ℃條件以3500 r/min離心10 min,取上清液采用比色法檢測(cè)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(Choline acetyltransferase,ChAT)和乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)活性,按照試劑盒操作,分別于520 nm和324 nm處測(cè)量吸光度值,根據(jù)其顏色深淺進(jìn)行比色定量。

1.7 炎癥因子表達(dá)水平檢測(cè) 取部分海馬組織稱重后按重量與0.9%氯化鈉溶液體積1∶10比例配置冰浴勻漿,充分研磨后4 ℃條件下以10000 r/min離心10 min,再取上清液檢測(cè)炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-10、TGF-β表達(dá)水平。檢測(cè)方法為ELISA,操作方法按照試劑盒說明書完成,于450 nm處檢測(cè)吸光值并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品炎癥因子水平。

1.8 NF-κB表達(dá)水平檢測(cè) 采取部分海馬組織稱重后按20 mg:150 μl的比例加入裂解液,于冰浴下勻漿,4 ℃條件下12000 r/min離心10 min,取上清液采用二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)法測(cè)定總蛋白濃度,分別用10%和4%的分離膠與濃縮膠對(duì)蛋白進(jìn)行處理,行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),電泳分離蛋白后進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜,以5%脫脂奶粉搖床室溫封閉1 h后加入以兔抗鼠NF-κB抗體并于4 ℃孵育過夜,室溫環(huán)境下以TBST沖洗3次,10 min/次,然后加入羊抗兔IgG二抗(使用HRP標(biāo)記),室溫環(huán)境孵育2 h,再以TBST洗滌3次,10 min/次,取出NC膜采用ECL試劑盒顯影,采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描并測(cè)定各條帶分光密度值,計(jì)算NF-κB相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠行為學(xué)評(píng)估結(jié)果比較 造模4周時(shí),模型組、美金剛組、頭針組和聯(lián)合組大鼠逃避潛伏期顯著升高(P<0.05),穿越原平臺(tái)次數(shù)顯著降低(P<0.05)。治療8周時(shí),美金剛組、頭針組和聯(lián)合組逃避潛伏期顯著降低(P<0.05),穿越原平臺(tái)次數(shù)顯著升高(P<0.05),且頭針組改善效果顯著優(yōu)于美金剛組(P<0.05),聯(lián)合組改善效果顯著優(yōu)于美金剛組和頭針組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠行為學(xué)評(píng)估結(jié)果比較

2.2 各組大鼠海馬組織ChAT和AChE活性比較 治療8周時(shí),模型組、美金剛組、頭針組和聯(lián)合組海馬組織ChAT和AChE活性均顯著低于正常組(P<0.05),頭針組和聯(lián)合組ChAT和AChE活性均顯著高于模型組和美金剛組(P<0.05),聯(lián)合組ChAT活性高于頭針組(P<0.05),見表2。

2.3 各組大鼠海馬組織炎癥因子表達(dá)水平比較 治療8周時(shí),模型組、美金剛組、頭針組和聯(lián)合組海馬組織TNF-α和IL-1β水平顯著高于正常組(P<0.05),IL-10和TGF-β水平顯著低于正常組(P<0.05);美金剛組、頭針組和聯(lián)合組TNF-α和IL-1β水平顯著低于模型組(P<0.05),IL-10和TGF-β水平顯著高于模型組(P<0.05),且頭針組TNF-α和IL-1β水平顯著低于美金剛組(P<0.05),IL-10和TGF-β水平顯著高于美金剛組(P<0.05);聯(lián)合組TNF-α和IL-1β水平顯著低于頭針組(P<0.05),IL-10和TGF-β水平顯著高于頭針組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠海馬組織炎癥因子水平比較(ng/mg)

2.4 各組大鼠海馬組織NF-κB表達(dá)水平比較 治療8周時(shí),模型組、美金剛組、頭針組和聯(lián)合組海馬組織NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著高于正常組(P<0.05);美金剛組、頭針組和聯(lián)合組NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05),且頭針組NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著低于美金剛組(P<0.05),聯(lián)合組NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著低于頭針組(P<0.05)。見圖1。

注:與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與美金剛組比較,△P<0.05;與頭針組比較,▲P<0.05

3 討 論

中醫(yī)將VD歸屬于“呆病”“健忘”或“不慧”等范疇,其病位在腦,《靈樞·大惑論》記載“上氣不足,下氣有余,故善忘也”,病機(jī)主要為陽(yáng)氣虛衰,血?dú)怵鰷?痰凝阻絡(luò),濁毒內(nèi)蘊(yùn),從而破壞腦髓,導(dǎo)致迷惑健忘,行動(dòng)呆滯等癥狀。本病為虛實(shí)夾雜之證,治療以補(bǔ)虛為主,同時(shí)兼顧祛邪,達(dá)到平衡陰陽(yáng),調(diào)和氣血的目的[7]。本研究建立大鼠VD模型進(jìn)行研究顯示,造模4周時(shí)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估逃避潛伏期,結(jié)果顯示模型組、美金剛組、頭針組和聯(lián)合組潛伏期時(shí)間更長(zhǎng),對(duì)比穿越平臺(tái)次數(shù),模型組、美金剛組、頭針組和聯(lián)合組次數(shù)更少,說明建模成功后大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯受損。對(duì)百會(huì)和四神聰進(jìn)行針刺,并于治療8周時(shí)逃避潛伏期降低,且穿越原平臺(tái)次數(shù)增加。百會(huì)是調(diào)節(jié)大腦功能的要穴,具有通達(dá)陰陽(yáng),貫通諸經(jīng)之功;四神聰可安心寧神,醒腦開竅。本研究結(jié)果顯示針刺百會(huì)和四神聰對(duì)VD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力有良好改善效果,且效果優(yōu)于西藥美金剛治療。頭針與美金剛聯(lián)合治療VD大鼠具有協(xié)同作用,有利于提升療效。

CAP是生物體內(nèi)廣泛分布的“免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌”信號(hào)通路,膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)與受體結(jié)合后可啟動(dòng)反饋調(diào)節(jié),從而產(chǎn)生抗炎效應(yīng)。Damodaran等[8]研究認(rèn)為大腦皮層和海馬等為較脆弱區(qū)域,缺血缺氧狀態(tài)下容易引起神經(jīng)元發(fā)生損傷,導(dǎo)致認(rèn)知障礙和造成記憶功能受損,刺激膽堿能系統(tǒng)利于改善認(rèn)知缺陷。ChAT為催化乙酰膽堿合成的酶,AChE為催化乙酰膽堿分解的酶,兩者活性變化可共同維持腦組織中乙酰膽堿動(dòng)態(tài)平衡[9-10]。本研究結(jié)果顯示模型組海馬組織ChAT和AChE活性較正常組和假手術(shù)組均明顯降低,表明ChAT和AChE活性降低可能是引起VD的重要因素,其機(jī)制可能與乙酰膽堿合成減少導(dǎo)致下游抗炎信號(hào)通路激活障礙有關(guān)。頭針治療可明顯提升VD大鼠海馬組織ChAT和AChE活性,與黃東挺等[11]報(bào)道顯示頭針可上調(diào)老年癡呆大鼠海馬組織乙酰膽堿表達(dá)水平的結(jié)果一致,有利于提升乙酰膽堿代謝轉(zhuǎn)換率,乙酰膽堿與受體結(jié)合激活抗炎通路,從而改善VD大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。本研究結(jié)果顯示頭針治療8周時(shí)VD大鼠海馬組織TNF-α和IL-1β表達(dá)水平顯著降低,同時(shí)IL-10和TGF-β表達(dá)水平顯著升高,表明針刺百會(huì)穴和四神聰有利于抑制促炎因子表達(dá),增強(qiáng)抗炎因子表達(dá),通過改善海馬組織炎癥反應(yīng),可減輕神經(jīng)功能損傷,促進(jìn)VD大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力恢復(fù),與李娜等[12]、鄧暢等[13]和田文靜等[14]研究結(jié)果相近。既往研究ChAT和AChE不僅參與調(diào)節(jié)乙酰膽堿代謝,還具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子樣作用,可促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育和再生[15]。TGF-β屬于肽類生長(zhǎng)因子,可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化,且對(duì)神經(jīng)元損傷和凋亡具有拮抗作用,有利于減輕認(rèn)知功能損害[16]。付倫姣等[17]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1/SMAD2信號(hào)通路被鈣通道α3亞基基因(GABRA3)所抑制,該機(jī)制會(huì)使神經(jīng)元凋亡被促進(jìn),突觸形成和遞質(zhì)釋放被抑制。

目前認(rèn)為針刺調(diào)控CAP的機(jī)制可能與NF-κB等信號(hào)通路密切相關(guān)。冷鳳等[18]建立Alzheimer’s病大鼠模型進(jìn)行研究顯示,預(yù)針刺可降低神經(jīng)炎癥反應(yīng)并改善學(xué)習(xí)記憶功能障礙,且其機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活存在密切聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示模型組、美金剛組、頭針組和聯(lián)合組海馬組織NF-κB蛋白表達(dá)水平顯著高于正常組,表明VD大鼠海馬組織NF-κB信號(hào)通路激活,頭針治療8周時(shí)NF-κB水平明顯降低,提示頭針治療VD可抑制NF-κB信號(hào)通路,從而抑制炎癥反應(yīng)水平。既往研究認(rèn)為針灸可刺激迷走神經(jīng),同時(shí)對(duì)ChAT和AChE活性進(jìn)行調(diào)控,從而調(diào)節(jié)乙酰膽堿合成和代謝,乙酰膽堿與免疫細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合后形成的復(fù)合物影響NF-κB等下游信號(hào)通路激活,產(chǎn)生抗炎作用[19]。針刺百會(huì)穴和四神聰則可抑制海馬細(xì)胞炎癥信號(hào)通路活化并減少細(xì)胞凋亡,同時(shí)還可改善血液循環(huán),抑制興奮性氨基酸毒性,通過多重生理機(jī)制促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)和重建[20]。本研究結(jié)果顯示對(duì)VD大鼠針刺百會(huì)穴和四神聰進(jìn)行治療有利于增強(qiáng)ChAT和AChE活性,提升乙酰膽堿代謝水平,增強(qiáng)CAP作用,從而達(dá)到改善大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的效果,且與興奮性氨基酸受體拮抗劑美金剛聯(lián)合治療可進(jìn)一步提升療效。