川芎嗪通過miR-34a對氧化型低密度脂蛋白誘導的冠狀動脈內皮細胞損傷的保護作用

顧民華,顧 勇

(海南省中醫院心血管科,海南 海口 570203)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是冠狀動脈血管發生動脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞,造成心肌缺血、缺氧或壞死而導致的心臟病,起病急驟且病死率極高,冠心病早期診斷及治療對改善其預后具有重要價值[1-2]。冠心病根據臨床表現分為穩定性冠心病和急性冠狀動脈綜合征,診療不及時往往導致患者發展成慢性心力衰竭而影響生存質量[3-4]。微小RNA(miRNA)為長度22 bp左右的非編碼小分子RNA,在基因轉錄后通過翻譯抑制或降解/裂解mRNA調控基因的表達。越來越多的研究證實miRNA參與了心血管疾病的發生、發展及轉歸,在冠心病發病機制、病情及預后評估中具有重要價值[5-6]。川芎嗪有抑制心肌收縮的作用,并使心率減慢,增加心臟灌流量及降低全血黏度,緩解主動脈痙攣性收縮,對心肌具保護作用,但其具體分子機制尚未明確[7-8]。本實驗旨在探討川芎嗪通過miR-34a對氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)誘導的人冠狀動脈內皮細胞(Human coronary artery endothelial cells,HCAECs)損傷的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 川芎嗪(純度98.5%)(中國藥品與生物制品檢定所);HCAECs(上海鈺博生物科技有限公司);ox-LDL(中國醫學科學院基礎研究所);DMEM培養基、FBS(北京Solarbio);丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所);Trizol試劑(大連寶生物公司);腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β) ELISA試劑盒(上海酶聯生物技術有限公司),實時熒光定量PCR相關試劑盒(北京天根公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養:HCAECs用含有10%FBS的DMEM培養基,于37 ℃、5% CO2培養箱常規培養。

1.2.2 實驗分組:Con組(正常培養人HCAECs),ox-LDL組(用50 mg/L的ox-LDL干預HCAECs),1、10、100 mmol/L組(HCAECs用1、10、100 mmol/L川芎嗪處理+ox-LDL干預),ox-LDL+anti-miR-NC組、ox-LDL+anti-miR-34a組、ox-LDL+miR-NC組、ox-LDL+miR-34a組(ox-LDL干預HCAECs分別轉染anti-miR-NC、anti-miR-34a、miR-NC、miR-34a模擬物),ox-LDL+miR-NC+100 mmol/L組、ox-LDL+miR-34a+100 mmol/L組(將miR-NC、miR-34a模擬物分別轉染至ox-LDL干預HCAECs+100 mmol/L川芎嗪)。

1.2.3 MDA及SOD檢測:收集上述各組細胞上清液,采用酶聯免疫吸附法檢測MDA及SOD,嚴格按照操作試劑盒說明書檢測。

1.2.4 miR-34a表達檢測:采用實時熒光定量PCR法(qRT-PCR)檢測miR-34a表達。采用Trizol試劑從HCAECs中提取總RNA后,微量核酸儀檢測RNA的純度和濃度。cDNA合成通過逆轉錄試劑盒進行,引物序列為上游引物5’-CTTGAACTCCTGGGGCCTGAAG-3’,下游引物為5’-GCCAAAGAAACACTCACAGCT-3’。按照95 ℃ 3 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s(35個循環)的程序進行PCR擴增。選擇U6為內參,參照2-ΔΔCt法計算miR-34a相對表達量。

1.2.5 試劑盒檢測細胞炎癥反應指標:提取HCAECs的上清液,采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測TNF-α及IL-1β,嚴格按照操作試劑盒說明書檢測。

2 結 果

2.1 川芎嗪對ox-LDL干預的HCAECs氧化應激和炎癥反應的影響 見表1。與Con組比較,ox-LDL組HCAECs的MDA含量、TNF-α、IL-1β水平升高,SOD活力降低,差異有統計學意義(P<0.05);與ox-LDL組比較,1、10、100 mmol/L組細胞MDA含量及TNF-α、IL-1β水平降低,SOD活力升高,差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 川芎嗪對ox-LDL干預的HCAECs氧化應激和炎癥反應的影響

2.2 川芎嗪對ox-LDL干預的HCAECs中miR-34a的影響 見表2。與Con組比較,ox-LDL組細胞miR-34a表達水平升高,差異有統計學意義(P<0.05);與ox-LDL組比較,1、10、100 mmol/L組細胞miR-34a表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 川芎嗪對ox-LDL干預的HCAECs中miR-34a的影響

2.3 抑制miR-34a表達對ox-LDL干預HCAECs氧化應激和炎癥反應的影響 見表3。與ox-LDL+anti-miR-NC組比較,ox-LDL+anti-miR-34a組細胞MDA含量以及TNF-α、IL-1β水平降低,SOD活力升高,差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 抑制miR-34a表達對ox-LDL干預HCAECs氧化應激和炎癥反應的影響

2.4 過表達miR-34a對ox-LDL干預HCAECs氧化應激和炎癥反應的影響 見表4。與ox-LDL+miR-NC組比較,ox-LDL+miR-34a組細胞MDA含量以及TNF-α、IL-1β水平升高,SOD活力降低,差異有統計學意義(P<0.05)。

表4 過表達miR-34a對ox-LDL干預HCAECs氧化應激和炎癥反應的影響

2.5 過表達miR-34a表達逆轉川芎嗪對ox-LDL干預HCAECs氧化應激和炎癥反應的影響 見表5。與ox-LDL+miR-NC+100 mmol/L組比較,ox-LDL+miR-34a+100 mmol/L組細胞MDA含量以及TNF-α、IL-1β水平升高,SOD活力降低,差異有統計學意義(P<0.05)。

表5 過表達miR-34a表達逆轉川芎嗪對ox-LDL干預HCAECs氧化應激和炎癥反應的影響

3 討 論

ox-LDL由低密度脂蛋白在氧化反應下產生,參與機體多種生理過程,在體外的主要用途已被用于建立動脈粥樣硬化模型,但大量證據表明即使在低濃度下也能成功誘導動脈粥樣硬化前的HCAECs功能障礙、死亡和病理性新血管形成,血清ox-LDL被鑒定為人類早期冠心病的危險因素[9-10]。ox-LDL可通過損傷血管內皮細胞、形成泡沫細胞、誘導免疫復合物產生免疫損傷等多種機制參與冠心病發病機制[11]。目前發現多種藥物可通過ox-LDL參與冠心病發病機制,ox-LDL可作為藥物及信號通路靶點[12]。冠心病是臨床最常見的心血管疾病,現代藥理研究將冠心病心絞痛分為虛實證,其中益氣活血通絡、益氣養陰、溫陽通絡等方法是治療虛證的主要手段;疏肝理氣化瘀、活血化瘀、祛痰化瘀等是治療實證的主要手段。川芎嗪是中藥川芎的有效成分之一,具有活血通絡等功效,可抗血小板聚集擴張小動脈,改善微循環以及活血化瘀,對冠心病及血管炎也有很好的治療作用[13]。劉英等[14]研究發現川芎嗪可減輕冠心病大鼠炎癥反應和氧化應激反應,在一定程度上改善心肌損傷,可能與激活AMPK/Nrf-2/HO-1信號通路有關。李一[15]研究表明,丹參川芎嗪注射液可減少冠心病發作的次數,縮短心絞痛持續的時間,提高其臨床療效,且用藥的安全性較高。李敏等[16]研究表明,丹參川芎嗪注射液對冠狀動脈粥樣硬化具有較好的效果。王國峰等[17]研究表明,川芎嗪降低ox-LDL誘導內皮細胞炎癥反應。闞科佳等[18]研究表明,舒洛地特對ox-LDL誘導人臍靜脈內皮細胞損傷的具有一定程度的保護作用。本實驗發現,ox-LDL干預增加HCAECs的MDA、TNF-α、IL-1β水平,但降低SOD活力;而川芎嗪可以拮抗ox-LDL干預的HCAECs的MDA、TNF-α、IL-1β水平增加和SOD活力降低。

miRNA為長度22 bp左右的非編碼小分子RNA,在基因轉錄后通過翻譯抑制或降解/裂解mRNA調控基因的表達。研究發現miR-34a與心臟病存在關聯,miR-34a參與心臟病發病機制[19]。黃仲略等[20]研究發現高糖刺激可促使H9c2心肌細胞凋亡,整個過程與miR-34a的高表達密切相關,可在臨床為糖尿病心肌病的預防與治療上提供新的思路。范麗等[21]發現miR-34a可抑制缺氧復氧損傷的人H9C2心肌細胞凋亡,其機制可能與促進PI3K磷酸化,活化PI3K/Akt信號通路,抑制細胞凋亡蛋白表達有關。基于目前的研究發現,推測miR-34a參與心臟相關疾病機制包括抑制心肌細胞凋亡、氧化應激及促進心肌細胞修復等。本實驗數據顯示,HCAECs中miR-34a表達水平在ox-LDL干預后增加,但在川芎嗪給藥后顯著降低。與ox-LDL+anti-miR-NC組比較,ox-LDL+anti-miR-34a組細胞MDA含量以及TNF-α、IL-1β水平顯著降低,SOD活力顯著升高。驗證 ox-LDL干預后,HCAECs 中miR-34a 表達與正常對照組比較,水平顯著升高;給予miR-34a 抑制劑后,細胞凋亡顯著降低[22]。miR-34a通過靶向SIRT1蛋白調控氧化型低密度脂蛋白介導的HCAECs凋亡。已經有研究報道,葡萄籽原花青素通過下調miR-34a減輕過氧化氫誘導的心肌細胞損傷。本實驗研究顯示,過表達miR-34a表達逆轉川芎嗪對ox-LDL干預HCAECs氧化應激和炎癥反應的影響。說明川芎嗪通過下調miR-34a減輕ox-LDL干預HCAECs損傷。

綜上所述,川芎嗪通過抑制miR-34a降低ox-LDL誘導的人HCAECs炎癥反應和氧化應激,川芎嗪可能為潛在的冠心病治療藥物。