肝癌患者血清VEGF、bFGF水平與癌組織微血管密度及介入術后早期復發的相關性

謝 俊, 梁先春, 黃緒蘭, 周 波

(重慶陸軍特色醫學中心大坪醫院肝膽胰外科, 重慶 400042)

原發性肝癌是臨床中發病率較高的消化道惡性腫瘤,世界范圍內每年新發肝癌中約50%發生在我國,肝癌已成為我國第二位惡性腫瘤死亡病因[1]。由于肝癌患者多合并肝硬化,肝臟代償功能差,手術切除率不足40%,且術后有極高的復發風險,有報道顯示肝癌術后5年復發率可達70%[2]。近年來研究發現,肝癌術后進行肝動脈化療栓塞術(TACE)能有效提高手術切除率及門脈癌栓清除率,延長無復發生存期,但仍有較高的復發風險[3]。因此,尋找可靠、便捷的分子標志物預測肝癌患者介入術后早期復發風險尤為重要。有研究顯示,血管內皮細胞生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)是參與腫瘤血管新生的強效活性因子[4]。另有研究表明,腫瘤微血管密度(MVD)是反映腫瘤新生血管數量的重要指標[5]。目前關于血清VEGF、bFGF水平與肝癌預后的關系尚存在爭議。本研究旨在探討血清VEGF、bFGF水平與肝癌組織MVD及介入術后早期復發的關系,以期為評估患者預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年7月至2021年6月在本院接受肝癌切除術并擬行肝動脈化療栓塞術(TACE)治療的225例肝癌患者,其中男性154例,女性71例;年齡35～72歲,平均年齡(56.23±7.11)歲;平均體質指數(BMI)(21.84±2.15)kg/m2;Child-Pugh分級:A級103例,B級122例;巴塞羅那臨床肝癌(BCLC)分期:B期115例,C期110期。納入標準:(1)符合中國抗癌協會肝癌專業委員會等制定的原發性肝癌相關診斷標準[6];經病理檢查確診;(2)擬行TACE治療,術前未接受放化療;(3)預計生存期>3個月;(4)年齡≥18歲;(5)美國東部腫瘤協作組(ECOG)體力活動評分低于3分;(6)患者簽署知情同意書。排除標準:(1)伴其他部位原發性惡性腫瘤者;(2)心、腎等重要臟器功能異常或TACE禁忌癥者;(3)伴嚴重內科疾病無法有效控制者;(4)伴精神障礙或中樞神經系統轉移、肝性腦病者;(5)參與其他臨床研究者。

1.2 血清VEGF、bFGF水平檢測TACE術前3 d采集所有患者空腹靜脈血5 mL,3 200 r/min,離心8 min,收集血清保存于-20℃待測。按照酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒說明書檢測血清VEGF、bFGF水平,VEGF試劑盒購自上海康朗生物科技有限公司(檢測范圍39.06～2 500 pg/mL,檢測限15.82 pg/mL,批間/批內變異度<10%,貨號KL-VEGF-Hu);bFGF試劑盒購自上海紀寧實業有限公司(檢測范圍2.5～80 pg/mL,檢測限0.1 pg/mL,批間/批內變異度<10%,貨號JN20824),與450 nm處檢測吸光度,根據標準曲線計算待測樣本濃度。

1.3 癌組織MVD檢測及分組取患者石蠟切片(厚度為5 μm),應用CD34單抗(武漢博士德)進行免疫組織化學染色,嚴格按照試劑盒說明書進行染色操作,按照文獻[7]的計數法進行MVD陽性判定:先在低倍視野下掃查切片,找到3個血管高密度區,切換高倍視野(HP,×400),棕黃色或棕色染色的單個或連續幾個內皮細胞作為1個MVD,管腔直徑>8個紅細胞并有較厚的肌層血管,染色模糊不清者不計數。由兩名病理科醫師雙盲法進行MVD判定,取平均值。經統計,肝癌患者癌組織MVD為(53.10±15.82)個/HP,以MVD平均值為分界將患者分為高MVD組(n=114)和低MVD組(n=111)。

1.4 治療方案肝癌切除術后1～2個月開始首次TACE治療,采用Seldinger法穿刺置管至腫瘤供血靶動脈,造影觀察腫瘤血供情況。以吉西他濱+順鉑+5氟尿嘧啶聯合方案緩慢灌注,再灌注10～30 mL超液化碘油,最后用可吸收明膠海綿顆粒填塞滿意,無明顯不良反應后退出導絲導管。根據患者腫瘤大小、有無癌栓等情況經評估后在TACE過程中同時注入15 mg恩度(山東先聲麥得津生物制藥有限公司,國藥準字S20050088,15 mg,0.8×105U/支),或靜脈滴注恩度15 mg/d,連用7 d。

1.5 臨床資料收集收集兩組患者基線資料,包括性別、年齡、BMI、飲酒史、Child-Pugh分級、ECOG評分、巴塞羅那臨床肝癌(BCLC)分期,有無乙型肝炎病毒(HBV)感染、是否合并肝硬化,病灶數目、包膜完整性、腫瘤直徑、病灶位置、分化程度,是否有門脈癌栓。

1.6 隨訪及分組首次TACE手術結束后開始隨訪,以電話或門診復診方式隨訪1年,以隨訪時間截止、復發為終點事件,采用薄層CT、數字減影血管造影等影像學技術明確患者復發情況,根據有無復發分為復發組(n=58)與非復發組(n=167)。

2 結果

2.1 肝癌患者血清VEGF、bFGF水平與癌組織MVD的相關性高MVD組血清VEGF、bFGF水平均高于低MVD組,差異具有統計學意義(P<0.05)。Pearson相關性分析顯示,血清VEGF、bFGF水平與癌組織MVD均呈正相關(r=0.469,P<0.001;r=0.505,P<0.001)。見表1和圖1。

圖1 血清VEGF、bFGF水平與癌組織MVD的相關性散點圖

表1 不同MVD患者血清VEGF、bFGF水平的

2.2 復發組與非復發組基線資料比較術后隨訪1年,患者復發率為25.78%(58/225),復發組多發病灶、無包膜/包膜不完整、腫瘤直徑>3 cm、低分化、門脈癌栓患者占比及血清VEGF、bFGF水平均高于非復發組,差異具有統計學意義(P<0.05);兩組在性別、年齡、BMI、Child-Pugh分級、ECOG評分、BCLC分期、HBV感染、合并肝硬化、飲酒史、病灶位置、介入治療方案方面比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 復發組與非復發組基線資料比較

2.3 TACE術后早期復發危險因素Logistic回歸分析將病灶數目(單發=0,多發=1)、包膜完整性(完整=0,無/不完整=1)、腫瘤直徑(≤3 cm=0,>3 cm=1)、分化程度(高分化=0,中分化=1,低分化=2)、門脈癌栓(無=0,有=1)、血清VEGF(連續變量)、血清bFGF(連續變量)作為自變量,肝癌患者TACE術后有無復發(無復發=0,復發=1)為因變量納入多因素Logistic回歸分析模型,結果顯示:無包膜/包膜不完整、腫瘤直徑>3 cm、門脈癌栓、VEGF高水平、bFGF高水平均是導致TACE術后早期復發危險因素(P<0.05)。見表3。

表3 TACE術后早期復發危險因素Logistic分析

2.4 不同表達水平的VEGF、bFGF患者無復發生存率的差異以VEGF平均值(280.55 pg/mL)為分界點分為高水平(n=103)和低水平(n=122),Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,VEGF高水平和低水平患者1年累積無復發生存率為65.0%、82.0%,平均生存時間分別為(10.75±0.22)個月和(11.60±0.10)個月,VEGF高水平和低水平患者累積無復發生存率比較,差異具有統計學意義(LogRankχ2=9.546,P=0.002),見圖2。

圖2 VEGF高水平和低水平患者累積無復發生存率的比較

以bFGF平均值(494.04 pg/mL)為分界點分為高水平(n=106)和低水平(n=119),Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,bFGF高水平和低水平患者1年累積無復發生存率為65.9%、81.5%,平均生存時間分別為(10.77±0.21)個月和(11.59±0.10)個月,VEGF高水平和低水平患者累積無復發生存率比較,差異具有統計學意義(LogRankχ2=8.210,P=0.004),見圖3。

圖3 bFGF高水平和低水平患者累積無復發生存率的比較

3 討論

原發性肝癌病因復雜,涉及HBV感染、黃曲霉病毒感染、遺傳等諸多因素,其起病隱匿、進展迅速,預后較差[8]。目前,手術切除仍是肝癌患者的首選治療方案,但患者術后無瘤生存期短,復發和轉移是影響手術效果的重要不利因素[9]。TACE是不可手術肝癌患者姑息治療方案,也是切除術后延長患者無瘤生存期的重要方法,但治療效果仍有待提高。研究發現,新生血管生成是癌細胞迅速增殖的基礎條件,也是癌細胞侵襲轉移的重要途徑,促使腫瘤復發[10]。探索影響新生血管生成的關鍵因子,如VEGF、bFGF等對肝癌介入術后早期復發的影響,有助于臨床制定針對性治療方案,延長患者無瘤生存期,改善患者的預后及生存質量。

本研究發現,高MVD組血清VEGF、bFGF水平均高于低MVD組,Pearson分析發現,血清VEGF、bFGF水平與癌組織MVD均呈正相關,提示肝癌患者血清VEGF、bFGF與癌組織MVD關系密切。TACE通過造成癌灶環境缺氧,抑制癌細胞增殖,但反之腫瘤微環境改變也會促使新生血管生成,導致腫瘤局部復發[11]。VEGF是一種血管內皮高度特異性有絲分裂素,在低氧環境下也能促使新生血管形成,同時能夠降解胞外基質增加腫瘤內新生血管通透性[12]。bFGF屬于多功能活性肽,生理狀態下在機體中含量甚微,但在創面愈合、腫瘤新生血管生成時表達水平升高[13]。Uz等[14]的研究發現,門靜脈栓塞術后,新西蘭大白兔非栓塞葉的MVD高于栓塞葉,表現為新生血管生成增多、VEGF表達增加,這可能為栓塞造成腫瘤局部缺氧導致非栓塞部位發揮代償功能所致。VEGF、bFGF均具有強烈促血管新生的作用,在接受介入栓塞治療的肝癌患者中,機體通過分泌過量的VEGF、bFGF,促使癌組織MVD升高[15]。

本研究發現,肝癌患者介入術后1年復發率為25.78%,應用多因素Logistic回歸模型剔除了病灶數目、分化程度等資料后發現,無包膜/包膜不完整、腫瘤直徑>3 cm、門脈癌栓均是導致TACE術后早期復發危險因素。腫瘤包膜完整性與其增殖速度及侵襲能力有關,無包膜/包膜不完整提示癌細胞有較強侵襲能力,復發風險高。本研究結果顯示,門脈癌栓可導致門靜脈高壓,門脈系統受累往往是肝內復發的重要因素,這與Chen等[16]報道一致。本研究結果顯示腫瘤大小與預后復發關系密切,腫瘤體積較大時癌細胞侵襲性較強,局部復發風險較高,這與Hong等[17]報道一致。

此外,本研究還發現VEGF和bFGF高水平也是導致復發危險因素,采用Kaplan-Meier分析發現,不同表達水平的VEGF、bFGF患者無復發生存率均存在差異,提示血清VEGF、bFGF高表達能增加TACE術后早期復發風險,二者低表達水平患者無復發生存期更長。Deng等[18]研究顯示,抑制肝癌患者VEGF、bFGF受體能夠增加抗程序性細胞死亡(PD-1)抗體治療效果,可能與調控腫瘤微環境中腫瘤血管正常化有關。VEGF、bFGF高表達患者介入術后早期復發風險更高,無瘤生存期縮短,其可能原因是:介入術后大部分癌細胞被清理,癌灶對氧需求量降低,VEGF、bFGF分泌水平下調[19];而VEGF、bFGF高水平患者更易促使局部新生血管生成,導致腫瘤復發,且高水平VEGF能夠增加供血動脈通透性,癌細胞更易發生轉移,導致預后不良[20]。

綜上所述,肝癌患者血清VEGF、bFGF水平與癌組織MVD關系密切,且二者是肝癌介入術后早期復發危險因素,血清VEGF、bFGF低表達水平患者無復發生存期更長,這可為評估接受肝癌介入手術患者術后早期復發提供參考依據。