不同梯度醇沉對紅芪多糖提取含量的影響及其抗氧化活性和紅外譜圖的分析

海力茜·陶爾大洪, 李明珠, 顧圓村, 錢方園, 阿曼妮薩·麥提如則, 卡地爾亞·庫爾班, 楊 飛

(新疆醫科大學藥學院, 烏魯木齊 830017)

關健詞：水提分級醇沉; 紅芪多糖; 含量測定; 抗氧化活性; 紅外表征

紅芪為豆科植物多序巖黃芪(HedysarumpolybotrysHand-Mazz)干燥的根,具有養血、壯陽、補氣、消腫、止汗、通痹等功效[1-2],其主要活性成分為多糖,能夠調節免疫力,抗腫瘤,減輕糖尿病并發癥,改善血脂代謝紊亂等藥理活性[3-7],臨床上主要用于抗衰老[8]、糖尿病[9]、心腦血管疾病[10]、腫瘤[11]、潰瘍[12]、骨質疏松[13]等的治療。紅芪多糖作為天然產物,與化學合成抗氧化藥物相比,毒副作用小且安全,可長期使用不造成蓄積[14]。本實驗針對紅芪多糖分級醇沉所得各級醇沉物質進行抗氧化活性篩選,為后續紅芪多糖的提取分離純化、藥理活性研究及藥物開發提供理論依據,現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器SL-200型粉碎機(浙江省金華市永康松青五金廠);N-1001型旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司);HWS-28型電熱恒溫水浴鍋(上海齊欣科學儀器有限公司);T6紫外-可見風光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

1.2 試劑雙氧水(分析純,上海遠大過氧化物有限公司);新亞銅(分析純,上海超聰化工有限公司;葡萄糖(分析純,天津市北聯精細化學品開發有限公司);苯酚(分析純,成都維克奇生物科技有限公司)。

1.3 藥材藥材紅芪于2021年2月購于甘肅完美商貿有限公司,經新疆醫科大學藥學院天然藥物化學教研室叢媛媛教授鑒定為多序巖黃芪(HedysarumpolybotrysHand-Mazz)的干燥根。

2 方法與結果

2.1 紅芪多糖的提取取10.0 g紅芪藥材粉碎,過篩備用。參考文獻[15]的方法,采用水提法,按料液比1∶30加入純化水,90℃水浴加熱回流3 h,過濾后將濾渣再次用純化水在90℃的水浴加熱回流中提取3 h,合并兩次提取液,并少量蒸餾水來洗滌殘渣,次數為2次,將洗滌液合并后再加入提取液中。將提取液減壓濃縮,平均分為4份,備用。

2.2 紅芪多糖的分級醇沉取4份濃縮液,加入適量無水乙醇,使其乙醇終濃度分別為20%、40%、60%和80%,在4℃下靜置12 h后棄去上清液,抽濾,收集沉淀物,將沉淀物進行冷凍干燥,備用,計算多糖提取率:多糖提取率/%=m1/m×100%(m1為紅芪多糖質量,m為紅芪的質量)。當乙醇濃度為20%、40%、60%和80%時,紅芪多糖的提取率分別為66.21%、67.1%、83.10%和84.80%。

2.3 標準曲線及含量測定

2.3.1 對照品儲備液的制備 稱取10.00 mg葡萄糖對照品于100 mL容量瓶中,用純化水定容至刻度,配置成0.1 mg/mL的對照品儲備液,備用。

2.3.2 供試品儲備液的制備 分別稱取20%、40%、60%、80%醇沉紅芪多糖沉淀樣品各0.1 g,分別置于100 mL容量瓶中,用純化水定容至刻度,分別吸取1 mL置于25 mL容量瓶中,用純化水定容至刻度,備用。

2.3.3 標準曲線的繪制 取“2.3.1”項下的對照品儲備液置于10 mL容量瓶,用純化水定容至刻度,配制成濃度分別為0.002、0.003、0.004、0.005、0.006 mg/mL的系列對照品溶液。分別取系列對照品溶液2.00 mL,加入5%苯酚溶液1.00 mL和5.00 mL濃硫酸,靜置30 min,用紫外分光光度計測定490 nm處吸光度,以多糖濃度為橫坐標(X),吸光度為縱坐標(Y),繪制標準曲線,得回歸方程:Y=15.25X-0.0512,r=0.999 7,紅芪多糖濃度在0.018 5～0.058 9 mg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.4 含量測定 取“2.3.2”項下4組供試品儲備液2.0 mL,按“2.3.3”項下方法測定多糖濃度,按公式:多糖含量/%=(C×V)÷m×100%計算,公式中C為紅芪多糖溶液的濃度,V為紅芪多糖溶液的體積,m為紅芪多糖的質量。乙醇的濃度為20%、40%、60%和80%醇沉得到的紅芪多糖含量分別為35.33%、37.76%、46.29%、61.62%。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度實驗 精密量取同一供試品(乙醇體積分數80%醇沉紅芪多糖)儲備液2.0 mL,按“2.3.3”項下方法測定5次計算多糖含量及RSD值。經計算紅芪多糖平均含量為63.24%,RSD為0.27%<2.0%,表明該方法精密度良好。

2.4.2 穩定性實驗 精密量取80%醇沉紅芪多糖供試品儲備液2.0 mL,在室溫的條件下放置,分別在時間為0、15、30、45、60 min按照“2.4.1”項下方法檢測A值分別為0.717、0.719、0.720、0.719、0.721。經計算紅芪多糖平均含量為63.11%,RSD為0.21%<2.0%,表明在1 h內該實驗穩定性良好。

2.4.3 重復性實驗 精密量取5份0.1 g的80%醇沉紅芪多糖沉淀樣品,按照“2.3.2”項下方法配制5份供試品溶液,精密量取每份供試品溶液2.0 mL,按”2.3.3”項下方法測定,計算多糖含量及RSD值。經測定A值分別為0.714、0.712、0.715、0.721、0.719,經計算紅芪多糖平均含量為62.90%,RSD為0.50%<2.0%。表明該實驗方法重復性良好。

2.4.4 加樣回收率實驗 取已知多糖含量的供試品儲備液,每份各0.5 mL,依次加入對照品儲備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL,采用硫酸-苯酚法測定490 nm處吸光度A。計算紅芪多糖的平均回收率為103.6%,RSD為1.31%<2.0%,表明該實驗方法準確度可靠。

2.5 抗氧化實驗

2.5.1 紅芪多糖對羥基自由基(·OH)的清除率 取由20%、40%、60%、80%醇沉得到的紅芪多糖,分別配置成0.25、0.5、1.00、2.00、3.00 mg/mL的多糖溶液,各取1 mL,并依次加入 Fe2SO4溶液(9 mol/mL)1 mL、水楊酸-乙醇溶液(9 mol/mL)1 mL、H2O2(8.8 mol/mL)1 mL,搖勻,反應1 h(37℃水浴)。測定510 nm處吸光度,重復上述操作3次,以Vc為陽性對照。計算·OH的清除率:·OH清除率/%=[1-(A1-A2)/A0]×100%,式中A0為空白組吸光度(純化水代替多糖溶液或Vc);A1為實驗組吸光度(Vc或多糖溶液);A2為底色校正吸光度(純化水代替H2O2)。在多糖的濃度為3 mg/mL條件下,4個組分的紅芪多糖對羥基自由基的清除率分別為:54.52%、41.24%、41.53%、65.43%,見表1。

表1 羥自由基清除率的測定結果

2.5.2 紅芪多糖對 DPPH自由基(·DPPH)的清除 取“2.5.1”項下配置的多糖溶液各2 mL,分布加入2 mol/mL的DPPH-無水乙醇溶液2 mL,混合均勻,在室溫的條件下避光反應,反應時間為30 min,檢測吸光值(517 nm),重復上述操作3次,將Vc作為陽性對照。利用以下公式求出·DPPH清除率:·DPPH清除率/%=[1-(A1-A2)/A0]×100%。上述式子中,A0為空白組吸光度(純化水代替VC或多糖溶液);A1為實驗組吸光度值(VC或多糖溶液);A2為底色校正吸光度(DPPH-無水乙醇溶液用無水乙醇來代替)。在多糖濃度為3 mg/mL條件下,4個組分的紅芪多糖對DPPH自由基的清除率分別為:61.74%、20.03%、96.00%、97.20%,見表2。

表2 紅芪多糖對DPPH自由基清除率的測定結果

2.5.3 紅芪多糖對與金屬Cu2+螯合能力的測定 取“2.5.1”項下配置的多糖溶液各1 mL于試管內,依次加入2.5 mol/mL的新亞銅試劑1 mL和0.01 mol/L的CuSO4溶液1 mL,搖勻后加入0.2 mol/L的醋酸銨緩沖溶液1 mL,混勻并靜置,靜置時間為30 min,測定450 nm處吸光度值在波長;以Vc為陽性對照組。計算銅離子的還原率:銅離子還原率/%=(A1-A0)/(Amax-A0)×100%,以上式子中,A0為空白組吸光度(純化水代替Vc或多糖溶液); A1為實驗組吸光度(Vc或多糖溶液),Amax為最大吸光度值。在多糖濃度為3 mg/mL條件下,4個組分的紅芪多糖對銅離子還原率分別為23.50%、24.60%、24.63%、25.64%,見表3。

表3 紅芪多糖對銅離子還原率測定的結果

2.6 紅外結構表征分別稱取2 mg 冷凍干燥的80%醇沉紅芪多糖和200 mg溴化鉀粉末,混勻研磨,壓片,用紅外光譜儀進行掃描,掃描的波長范圍是近紅外區(4 000～ 400 cm-1)。紅芪多糖在3 282.84 cm-1處出現較寬的吸收峰,說明結構里存在官能團羥基(-OH)[16]。2 931.80 cm-1波長附近有次甲基(C-H)的吸收峰,1 624.06 cm-1波長附近有羰基(C=O)的吸收峰(伸縮振動產生),說明結構中含有糖醛酸。1 411.89 cm-1及1 045.42 cm-1波長的吸收峰是(C-O-C)和(C-O)的是,由伸縮振動引起的[17],見圖1。

圖1 紅芪多糖的紅外分析譜圖

3 討論

紅芪多糖的提取方法多樣,本課題組前期采用單因素和響應面法對紅芪多糖水提加熱回流的提取條件進行了研究[18],但對相應的醇沉條件缺乏研究。由于植物多糖結構多樣,分子量跨度范圍廣,極性也有所不同,隨著醇沉時乙醇濃度的增加,極性大的多糖先沉淀析出,而極性較小的多糖后析出,因此在本實驗中,紅芪多糖在最大乙醇體積分數時(80%)提取率和含量最高。

紅芪多糖具有多種藥理活性,特別是抗氧化活性,寇寧等[19]研究了不同提取方法對紅芪多糖抗氧化活性的影響。本研究發現,高濃度的紅芪多糖具有較好的抗氧化活性,且多糖濃度與醇沉濃度呈依賴性,故提取率和多糖含量最高的80%乙醇醇沉得到的紅芪多糖具有較高的抗氧化活性,其對DPPH自由基的清除能力最為顯著,且與天然抗氧化劑Vc的作用相近。但20%乙醇醇沉得到的紅芪多糖整體抗氧化活性要強于40%乙醇醇沉得到的紅芪多糖。由于植物多糖的抗氧化活性受其蛋白質、肽、和色素等的影響[20],推測是由于20%乙醇醇沉得到的紅芪多糖含有更多的色素或蛋白質類雜質所致;另外植物多糖的生物活性亦與分子構型密切相關[20],而20%乙醇醇沉得到的紅芪多糖皆是極性和分子量較大的分子,這也是其抗氧化活性強于40%乙醇醇沉得到的紅芪多糖的原因。因此紅芪多糖可以作為一種天然的抗氧化劑,來替代毒性較強的人工合成抗氧化劑,并以此為基礎開發其藥物、功能性食品和化妝品等領域的應用價值。

紅外圖譜分析結果得知抗氧化活性最優的80%乙醇醇沉得到的紅芪多糖中富含羥基、羰基等還原性基團,初步推測其為紅芪多糖抗氧化活性的結構基礎。但是由于粗多糖種類多樣、結構復雜的特點,本研究未能準確推斷出紅芪多糖的化學結構,可通過對紅芪多糖甲基化、結合核磁共振與質譜技術進一步研究分析。本實驗為后續紅芪多糖的提取分離、藥理活性研究及藥物開發提供了理論依據,為紅芪多糖的抗氧化活性和機制的相關研究奠定了實驗基礎。